cDNA的合成實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>
掌握植物cDNA合成的原理和方法
二、實(shí)驗(yàn)原理
反轉(zhuǎn)錄酶主要用于體外cDNA的合成。目前最常用的反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)
有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它們具有依賴于RNA或DNA的DNA聚合酶活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子為模板，合成出一條DNA鏈。形成的DNA是與RNA模板互補(bǔ)的，因而反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA分子稱之為cDNA。
三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品
植物總RNA溶液。 紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、冰盒、口罩、手套、EP管架、超凈工作臺(tái)、移液器、DEPC處理過(guò)的槍頭、EP管等。 5×M-MLV
RT Buffer、 2.5mM dNTP mix 、 RNase抑制劑(30U/μL)、M-MLV Reverse
Transcriptase、 Oligo(dT)18 primer、無(wú)菌的DEPC水等。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
注意：戴手套進(jìn)行以下操作，嚴(yán)防RNase污染。
1．在超凈工作臺(tái)上吸取1ml無(wú)菌水到EP管中,加入2μl植物總RNA溶液,充分混勻，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定260,280nm的光吸收值(OD 值),然后計(jì)算RNA的濃度,并分析其純度。
分光光度（紫外吸收）法
（1）預(yù)熱紫外分光光度計(jì)10—20分鐘。
（2）取兩只比色杯，一只裝入1ml H2O溶液，作為空白溶液，用來(lái)校正分光光度計(jì)零點(diǎn)及調(diào)整透光度至100。
（3） DNA純度及濃度測(cè)定：
① 取2ul DNA或RNA樣品加入另一比色杯，加dH2O 至1000ul, 混勻。
②將兩只比色杯置分光度計(jì)中，調(diào)入射光波長(zhǎng)，分別用空白溶液調(diào)整零點(diǎn)（T為100，OD為0），測(cè)定待測(cè)樣品液在260nm、280nm、230nm的OD值。
③計(jì)算濃度：對(duì)于雙鏈DNA 1.0 OD260=50ug/ml,
對(duì)單鏈RNA1.0 OD260=40ug/ml。
④測(cè)定純度： v純的RNA溶液其OD260/OD280 的比值應(yīng)介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值應(yīng)大于2.0。
?RNA樣品OD260/OD280的比值太小，說(shuō)明有蛋白或苯酚污染。比值大于2.0，則可能被異硫氰酸胍污染。
?OD260/OD230的比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。
純的DNA溶液其OD260/OD280應(yīng)為 1.8，OD260/OD230應(yīng)大于2.0。
?OD260/OD280大于1.9時(shí)，表明有RNA污染，小于1.6時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染。
?OD260/OD230小于2.0時(shí)，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。
2．在DEPC處理過(guò)的Ep管中加入約4μg總RNA和1μl 0.5μg/μl的 Oligo(dT)18 primer,小心混勻, 70℃保溫5分鐘,立即浸入冰水中。
3．按次序分別加入下列試劑：
5μl 5×M-MLV RT Buffer
2μl dNTP mix(2.5mM)
1μl RNase抑制劑(30U/μL)
1μl M-MLV Reverse Transcriptase
然后加DEPC水到25μl.
4． 小心混勻，室溫離心5秒，將所有溶液收集到管底， 37℃保溫1小時(shí)。
5． 90℃處理5分鐘，冰上冷卻?！?br>
6． 用于PCR擴(kuò)增或-20℃保存?zhèn)溆?
