納米材料在體外診斷技術(shù)中的應(yīng)用（二）
2 納米材料的不同信號模式在體外診斷中的應(yīng)用
在過去的20多年里，大量的納米材料被開發(fā)應(yīng)用于體外診斷中，納米材料獨特的性能被用來提高傳統(tǒng)體外診斷技術(shù)的檢測性能以及開發(fā)全新的檢測方法。其中利用納米材料的熒光信號、表面增強拉曼信號、磁信號、電化學(xué)信號、顏色信號及熱信號等作為體外診斷的信號檢測模式最具代表性（表1）。
2.1 基于熒光信號的納米體外檢測應(yīng)用
基于熒光的檢測技術(shù)主要用于目標(biāo)物為核酸或者蛋白的檢測。但是，傳統(tǒng)的熒光染料由于容易光漂白、量子效率不高及較寬的熒光光譜等導(dǎo)至其多指標(biāo)檢測能力有限。而窄的吸收光譜導(dǎo)至不同的熒光染料需要不同的激光器來激發(fā)，因此，半導(dǎo)體量子點常被用來解決傳統(tǒng)熒光染料的這些缺陷。量子點在酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）免疫檢測和DNA微陣列檢測中可用做報告熒光分子實現(xiàn)化學(xué)殘留物和癌癥抗原標(biāo)志物的單指標(biāo)或者多指標(biāo)的檢測（圖3（a）），這個系統(tǒng)檢測肌紅蛋白的檢測限（LOD）可達(dá)subattomolar級別。量子點還可以應(yīng)用于基于能量轉(zhuǎn)移（FRET）的檢測和多指標(biāo)檢測（圖3（b、c））。FRET檢測系統(tǒng)利用量子點作為能量給予體，可以將其能量轉(zhuǎn)移給受體或者猝滅劑，以實現(xiàn)小分子及核酸的檢測，其靈敏度可分別達(dá)到10~103 nmol/L及1~103 nmol/L。量子點的多指標(biāo)檢測能力主要來源于其熒光編碼能力，將不同組合的量子點引入聚合物微球中可以產(chǎn)生不同的熒光編碼。量子點編碼的微球表面可修飾DNA捕獲探針，通過和熒光染料標(biāo)記的目標(biāo)DNA雜交后可同時產(chǎn)生編碼信號和檢測信號。研究表明，基于量子點編碼微球的檢測體系已成功實現(xiàn)了多種疾病的生物標(biāo)志物檢測，靈敏度高達(dá)pM級別。此外，在量子點編碼微球表面包覆一層金屬納米殼層可通過金屬增強熒光效應(yīng)進(jìn)一步提高其檢測靈敏度（2個數(shù)量級），同時還可以獲得更好的微球穩(wěn)定性。量子點編碼微球檢測體系的多指標(biāo)檢測能力對于體外檢測技術(shù)發(fā)展非常有利，可以有效降低多指標(biāo)檢測過程的人力成本和時間成本。近年來，一些新型納米發(fā)光材料也被用于實現(xiàn)體外多指標(biāo)檢測。
金納米顆粒由于其表面等離子共振效應(yīng)，可用來淬滅其表面附近熒光染料的熒光。這種淬滅效應(yīng)可以在較長的距離（約為75 nm）起作用，且依賴于金納米顆粒的形狀和大小。因此，金納米顆粒可用于基于FRET的體外檢測，在檢測過程中，激發(fā)態(tài)電子的能量以非輻射躍遷的形式從熒光染料分子轉(zhuǎn)移到納米顆粒。該檢測方法同樣顯示出改善的檢測靈敏度、更好的選擇性以及可同時淬滅多種熒光染料。此外，在金納米顆粒-量子點檢測系統(tǒng)中，量子點同樣可被高效地淬滅，可應(yīng)用于定量檢測流感病毒的抗原及細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度，靈敏度可分別高達(dá)100 pmol/L和0.1PFU/mL。與金納米顆粒類似，氧化石墨烯同樣可以淬滅其表面附近熒光染料及量子點的熒光信號。氧化石墨烯可以偶聯(lián)染料標(biāo)記的單鏈DNA探針，并在目標(biāo)DNA不存在的條件下淬滅其熒光信號，但是在與目標(biāo)DNA片段結(jié)合后，DNA將從石墨烯表面釋放，從而恢復(fù)熒光信號。
2.2 基于拉曼信號的納米體外檢測應(yīng)用
拉曼光譜學(xué)是一種通過分析材料的散射光譜獲得材料分子的轉(zhuǎn)動及振動方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的分析方法。由于拉曼光譜包含具有多種元素特異性的光譜信號，其光譜的半高寬（FWHM）可窄至1nm，因此這種技術(shù)有望應(yīng)用于多指標(biāo)檢測。最近研究人員通過調(diào)控炔烴的化學(xué)結(jié)構(gòu)（苯環(huán)數(shù)目，C≡C數(shù)目，官能團(tuán)鄰間對位置以及不同的同位素），得到了一系列具有典型的拉曼特征峰的聚炔烴，且光譜很窄，并將其命名為Carbow。通過溶脹法可將10種不同拉曼特征峰的聚炔烴和3個強度水平進(jìn)行微球編碼，理論上可以得到310-1=59048個光譜編碼的超級微球編碼庫（圖4（a））。但是，傳統(tǒng)的拉曼散射通常伴隨著低的吸收截面，大大限制了檢測靈敏度。金屬納米顆粒的表面等離子共振效應(yīng)可用來增強拉曼信號（圖4（b））。當(dāng)拉曼分子接近金納米顆粒表面或者處于2個或多個納米顆粒之間的交叉SPR場產(chǎn)生的“熱點”位置時，該信號將大大的增強（可高達(dá)1011倍），從而實現(xiàn)高靈敏的單分子檢測。由于其吸收峰面積與濃度相關(guān)，因此可用來對目標(biāo)分子進(jìn)行定量分析。
產(chǎn)生強的“熱點”，需要精確地控制納米顆粒的形狀，因此制備過程中費時費力。而且表面增強拉曼探針和熱點之間的距離也需要非常嚴(yán)格地控制，距離相差幾個納米就有可能在增強信號上相差幾個數(shù)量級。這將導(dǎo)至不同探針之間的增強性能差別較大，使定量分析復(fù)雜化?；谝陨蠁栴}的考慮，大部分應(yīng)用都是基于靈敏度更低的塊體系統(tǒng)而不是單分子的納米系統(tǒng)，其表面拉曼增強效果主要通過將探針固定在溶液體系的金屬納米顆粒表面獲得。目前該技術(shù)已經(jīng)成功用于核酸檢測（10~100 pmol/L LOD）、蛋白檢測（100 pmol/L LOD）、腫瘤細(xì)胞檢測、細(xì)菌檢測（250 cell/mLLOD）、病毒檢測（100 PFU/mL LOD）及活細(xì)胞內(nèi)小分子藥物的示蹤（100 pmol/L LOD）（圖4）。該技術(shù)的主要缺點是探針必須在納米顆粒的表面，限制了納米顆粒的表面化學(xué)選擇。此外，表面增強拉曼效應(yīng)需要高能量激光器激發(fā)并且需要貴重的設(shè)備類獲得信號，這阻礙了該技術(shù)應(yīng)用于快速檢測應(yīng)用轉(zhuǎn)化。
2.3 基于磁性能的納米體外檢測應(yīng)用
由于磁性納米顆粒在磁場條件下可以分離不同的反應(yīng)物，因此已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物檢測試劑的開發(fā)上。在生物檢測中使用磁性納米顆粒可簡化檢測過程中涉及分離或者洗滌步驟的設(shè)計，常規(guī)的量子點編碼微球檢測體系可通過在編碼過程中加入磁性納米顆粒，結(jié)合磁場和微流控設(shè)備實現(xiàn)其自動化檢測，將整個檢測過程簡化（圖5）。磁分離同樣被用在高靈敏度生物編碼檢測技術(shù)上，該檢測將磁性納米顆粒和金報告納米顆粒相結(jié)合，2種顆粒的表面都修飾了核酸或者蛋白，用來識別和結(jié)合目標(biāo)分析物。結(jié)合分析物可將2種顆粒橋接在一起，使得金納米顆粒可隨著磁性納米顆粒通過磁場被分離出來。這樣編碼DNA可從金納米顆粒上釋放出來，最終通過檢測儀檢測出來。
磁性納米顆粒同樣可以直接用作報告探針，通過其產(chǎn)生的磁信號指示目標(biāo)分子的存在。樣品的橫向弛豫時間（T2）的變化可通過微型核磁共振儀檢測出來，該變化可通過目標(biāo)DNA存在的情況下用磁性納米顆粒修飾微球的表面，用磁性納米顆粒標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞的表面、目標(biāo)分析物存在的情況下磁性納米顆粒之間的團(tuán)聚等方式獲得。研究結(jié)果表明該技術(shù)可成功實現(xiàn)蛋白（1 pmol/L LOD）、核酸（0.2~10 pmol/L LOD）、腫瘤細(xì)胞（2 cell）和細(xì)菌（1 CFU/uLLOD）的檢測。
磁性納米顆粒同樣可以直接用作報告探針，通過其產(chǎn)生的磁信號指示目標(biāo)分子的存在。樣品的橫向弛豫時間（T2）的變化可通過微型核磁共振儀檢測出來，該變化可通過目標(biāo)DNA存在的情況下用磁性納米顆粒修飾微球的表面，用磁性納米顆粒標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞的表面、目標(biāo)分析物存在的情況下磁性納米顆粒之間的團(tuán)聚等方式獲得。研究結(jié)果表明該技術(shù)可成功實現(xiàn)蛋白（1 pmol/L LOD）、核酸（0.2~10 pmol/L LOD）83]）、腫瘤細(xì)胞（2 cell）和細(xì)菌（1 CFU/uLLOD）的檢測。
2.4 基于電化學(xué)信號的納米體外檢測應(yīng)用
電化學(xué)生物檢測是過去50年來逐漸發(fā)展起來的另一類生物傳感技術(shù)。該技術(shù)的核心是傳感器，它可以將與化學(xué)分析物相互作用后使系統(tǒng)電學(xué)性能（如電流、電位或者阻抗）發(fā)生變化的信號通過電子設(shè)備檢測出來。這種技術(shù)主要有生物催化傳感和生物親和性傳感2種檢測途徑。在生物催化傳感途徑中，酶被固定在電極的表面，其底物為目標(biāo)分析物。當(dāng)酶與分析物相結(jié)合后，將產(chǎn)生電活性的化學(xué)物質(zhì)，或者直接將電子傳遞到電極。一般采用高催化活性的酶可獲得高檢測靈敏度（fmol/L）（圖6（a）），而底物的特異性結(jié)合將使得復(fù)雜的混合物檢測不需要樣品的預(yù)處理。但是，這種方法的主要缺點是酶只能用于有限數(shù)量的底物。而在生物親和性傳感檢測途徑中，電極上一般預(yù)先包覆抗體或者DNA探針，用于識別目標(biāo)蛋白、小分子抗原或者用來和互補的DNA雜化。當(dāng)目標(biāo)物和這些探針結(jié)合后將調(diào)節(jié)表面的電學(xué)性能，從而改變檢測的電信號。由于抗體可用于大量抗原，而DNA探針則可被設(shè)計成各種序列，因此這種技術(shù)可以推廣至多種目標(biāo)檢測物。但是，由于沒有信號放大的步驟，該檢測方法的檢測靈敏度仍然受到一定的限制。
為了提高生物親和性電化學(xué)傳感的檢測靈敏度，多種基于納米材料的檢測方法被開發(fā)出來。如采用不同的抗體受體修飾納米線場效應(yīng)管后用于檢測單個病毒顆粒（圖6（b））。電極上也可以包覆上金納米顆?；蛘咛技{米管，通過改變其阻抗從而獲得更高的檢測靈敏度。目前采用該技術(shù)已成功實現(xiàn)了DNA（pmol/L LOD）、蛋白質(zhì)（1 nmol/L LOD[91]）、病毒（單個）及細(xì)菌（10~100個）的高靈敏檢測。而采用納米顆粒-標(biāo)記表面-結(jié)合分析物的類三明治結(jié)構(gòu)可以通過提高阻抗強度的調(diào)節(jié)來獲得更高的檢測靈敏度，從而成功實現(xiàn)核酸（fmol/L LOD）和蛋白質(zhì)（fmol/L LOD）的檢測。DNA的多指標(biāo)檢測則可通過使用多種具有不同伏安特征的納米晶標(biāo)記實現(xiàn)。當(dāng)然，電化學(xué)生物檢測技術(shù)也同樣存在一些缺點，包括非特異性吸附、需要控制檢測溶液的離子強度以及相對短的使用壽命等。
2.5 基于顏色變化的納米體外檢測應(yīng)用
比色檢測和其他檢測方法相比的優(yōu)勢在于不需要任何的設(shè)備來讀取信號，因此特別適合快速檢測的應(yīng)用。目前報道最多的是利用金納米顆粒聚集后顏色發(fā)生變化來進(jìn)行檢測。由于SPR效應(yīng)，金納米顆粒在可見光范圍顯示出很強的吸收。常用于體外檢測的金納米顆粒粒徑一般約為13 nm，其吸收峰約在520 nm，導(dǎo)至其溶液顯示出亮紅色。但是，當(dāng)金納米顆粒之間的距離小于它們的粒徑時，它們的SPR場將發(fā)生耦合共振，使得溶液吸收峰向長波方向紅移，導(dǎo)至溶液顏色發(fā)生從紅到藍(lán)的逐漸變化，且容易通過肉眼識別。目前已經(jīng)有很多利用金納米顆粒連接分析物導(dǎo)至其聚集，從而產(chǎn)生顏色變化，最終實現(xiàn)目標(biāo)物的比色檢測。
該比色檢測技術(shù)可采用1種或者2種探針的策略實現(xiàn)目標(biāo)物的檢測（圖7）。單探針策略中，金納米顆粒表面用1種可和目標(biāo)DNA互補的DNA探針修飾。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時，由于金納米顆粒表面的探針可以和目標(biāo)DNA雜化，使得其可保持單分散性而不會聚集。而當(dāng)目標(biāo)DNA不存在時，由于溶液中鹽的濃度較高將導(dǎo)至金納米顆粒聚集，發(fā)生從紅到藍(lán)的顏色變化。雙探針策略中，2種金納米顆粒分別修飾不同的探針。當(dāng)目標(biāo)DNA存在時，2種金納米顆粒通過目標(biāo)DNA發(fā)生交聯(lián)最終發(fā)生聚集。而目標(biāo)DNA不存在時，2種金納米顆粒都可以以單分散的形式穩(wěn)定存在于溶液中。盡管基于金納米顆粒聚集反應(yīng)的比色檢測簡單、快捷且不需要任何貴重的檢測設(shè)備，但是檢測過程沒有信號放大的步驟，導(dǎo)至其檢測靈敏度有限（nmol/L級別）。金納米顆粒與DNA 酶的偶聯(lián)可以提供信號的線性放大，從而提高核酸檢測的靈敏度。金納米顆粒在從聚集態(tài)變化到單分散狀態(tài)的過程中其吸收峰會發(fā)生藍(lán)移，使溶液的顏色由暗紫色變?yōu)榧t色。因此，基于多組分核酸酶修飾金納米顆粒的檢測可提供簡單、快捷的比色檢測，適用于核酸的快速檢測。但是對于檢測一些濃度較低的目標(biāo)物時仍然需要增加額外的信號放大步驟。
2.6 基于熱信號的納米體外檢測應(yīng)用
可以產(chǎn)生熱的納米顆粒一般常見于腫瘤組織的熱療應(yīng)用中。最近已有研究開始利用金屬納米顆粒的熱性能用于疾病的檢測上。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多類型的納米材料可以在光或者電的激發(fā)下產(chǎn)生熱，例如金納米棒和碳納米管等可在近紅外激光的照射下產(chǎn)生熱。被激發(fā)后，納米材料中的電子和局部的水分子發(fā)生相互作用，當(dāng)它們躍遷到基態(tài)時則發(fā)生振動和散熱。最近，研究人員利用熱成像技術(shù)探索了金納米顆粒在側(cè)向?qū)游鰴z測中的應(yīng)用（圖8）。在該系統(tǒng)中，抗體標(biāo)記的金納米顆粒作為對比劑產(chǎn)生的熱信號可被熱檢測儀放大并檢測出來。該檢測儀可將激光波長和金納米顆粒的等離子共振峰進(jìn)行匹配，并用近紅外探測器來檢測溫度的上升，最終實現(xiàn)金納米顆粒信號的定量檢測。目前，使用熱對比信號檢測可將側(cè)向?qū)游鰴z測靈敏度提高32倍。通過使用熱對比信號放大檢測儀，在側(cè)向?qū)游鰲l上檢測甲型流感、瘧疾和艱難梭菌與傳統(tǒng)可視化層析檢測相比，其靈敏度可提高8倍。盡管該技術(shù)還處于發(fā)展初期，研究結(jié)果表明該技術(shù)不僅可保持側(cè)向免疫層析檢測技術(shù)的簡便性，還可提供更高的檢測靈敏度，有望應(yīng)用于更為復(fù)雜的分子檢測。此外，目前眾多光熱性能優(yōu)異的納米材料同樣為基于熱信號體外檢測技術(shù)的發(fā)展提供了更多選擇。
3 結(jié)論
納米材料近年來已被成功用于提高體外檢測的靈敏度，提供不同的讀出信號，并且可同時檢測多個目標(biāo)物并簡化檢測過程。基于納米材料的體外檢測可設(shè)計為顏色、熱、熒光、磁、電化學(xué)及拉曼信號顯示，有利于在檢測系統(tǒng)中提供多種功能選擇。顯然，納米體外診斷技術(shù)在諸多應(yīng)用領(lǐng)域已呈現(xiàn)極大潛力，特別是在快速檢測方面。但是，要實現(xiàn)納米體外診斷技術(shù)在體外診斷領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化，仍然還有不少壁壘需要克服。
1）納米材料在體外檢測應(yīng)用中涉及納米材料的設(shè)計、合成、表面修飾和生物偶聯(lián)等多個步驟，這些步驟對于確定納米探針的整體性能非常重要。由于納米材料表面化學(xué)的復(fù)雜性，因此發(fā)展更好的制備（特別是宏量制備）及修飾技術(shù)以獲得性能重復(fù)性優(yōu)異、表面涂層堅固以及功能化和生物偶聯(lián)過程靈活的納米探針至關(guān)重要。
2）目前的納米體外診斷技術(shù)大多包括多個操作步驟，如樣本的提取、純化和檢測，而這些過程均需要專業(yè)熟練的人員完成。因此，通過開發(fā)一體化的便攜式設(shè)備實現(xiàn)自動檢測，減少人力勞動，也是未來的發(fā)展方向。
3）目前很多納米檢測試劑盒還處于臨床前的階段，仍然需要從實際臨床的角度通過大量臨床樣本來驗證全面評價這些技術(shù)的性能。在納米體外診斷技術(shù)的研發(fā)早期對其進(jìn)行臨床的評估有助于加速其臨床轉(zhuǎn)化，這樣病人樣本的多樣性特點可以在技術(shù)設(shè)計過程就被考慮在內(nèi)。
顯然，從事納米體外診斷技術(shù)的研究者應(yīng)該聚焦于解決以上這些問題，這將有助于這些基于納米材料的體外診斷技術(shù)最終實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，服務(wù)于社會，造福于普通百姓。
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