DNA重組技術(shù)(Recombinant DNA)實(shí)驗(yàn)原理、用品和步驟（一）
【實(shí)驗(yàn)原理】
1．DNA重組技術(shù)
重組DNA(Recombinant DNA)技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟：
1）重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應(yīng)用TA克隆方法,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過(guò)程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì),設(shè)計(jì)一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。
2）將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
3）克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量含重組DNA的細(xì)菌。
4）收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。
2．質(zhì)粒DNA的小量制備
常見(jiàn)的質(zhì)粒DNA提取方法有簡(jiǎn)易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實(shí)驗(yàn)采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH
12.0~12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，將可去除大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DNA。
3．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）切分析
限制酶存在于原核生物體內(nèi)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能特性分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切點(diǎn)不固定，Ⅲ型其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外，只有Ⅱ型其特異性切點(diǎn)位置可以控制和預(yù)測(cè)，可以產(chǎn)生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為Ⅱ型限制酶。這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi)切斷DNA雙鏈，形成一定長(zhǎng)度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對(duì)重組的環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用已知相對(duì)分子量的線狀DNA（DNA分子量標(biāo)志）及未經(jīng)酶切的重組環(huán)狀質(zhì)粒為對(duì)照，可以對(duì)重組環(huán)狀質(zhì)粒中的目的DNA分子進(jìn)行初步鑒定。
【實(shí)驗(yàn)用品】
1．PCR擴(kuò)增儀；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱；臺(tái)式高速離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀； 電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動(dòng)成像儀。
2．三角燒瓶（500ml, 250ml,100ml）,培養(yǎng)皿，玻璃試管，試管塞，玻璃棒，酒精燈，鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇，容器盒。
3．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。
4．DNA重組相關(guān)試劑：
1）Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：pMD18-T；感受態(tài)細(xì)菌；氨芐青霉素（100mg/ml）。
2） LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉 10g，10N NaOH調(diào)pH至7.0定容至1L。15磅高壓消毒，4℃保存。
3）LB瓊脂培養(yǎng)基：15g瓊脂粉溶于1000ml LB培養(yǎng)基，15磅高壓消毒備用。
5．質(zhì)粒提取試劑：
溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高壓消毒，4℃保存?zhèn)溆?
溶液Ⅱ:0.2N NaOH;1%SDS 室溫貯存，即用即配。
溶液Ⅲ:3M NaOAc(pH4.8) 10磅高壓消毒,室溫貯存。
RNA酶 A: 10mg/ml
TE緩沖液：10mM Tris-Cl (pH7.6)，1mM EDTA(pH8.0)
6．質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑：
限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、XbalⅠ及酶反應(yīng)所需緩沖液；瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（10mg/ml）；6×載樣緩沖液。
Tris-乙酸(TAE)貯存液：
50×：242克Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
加水至1L
