CRISPR的優(yōu)勢(shì)分析
時(shí)至今日，很多研究者仍著迷于研究細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)的功能，以及如何借助對(duì)相關(guān)機(jī)制的理解來(lái)產(chǎn)生新的技術(shù)。CRISPR系統(tǒng)目前在臨床診斷與基因療法中的研究成果也在不斷涌出。近日，Sherlock Biosciences公司宣布其基于CRISPR技術(shù)的新冠病毒試劑盒已獲得美國(guó)FDA的緊急使用授權(quán)。這是FDA首次批準(zhǔn)基于CRISPR基因編輯技術(shù)的新冠病毒檢測(cè)產(chǎn)品，也是首次授權(quán)使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行傳染病檢測(cè)。
?
一、CRISPR-Cas是細(xì)菌體內(nèi)精妙的防護(hù)系統(tǒng)
?
CRISPR的全名是“規(guī)則間隔簇狀的短回文重復(fù)序列”，最初在研究者細(xì)菌和古細(xì)菌的DNA中發(fā)現(xiàn)了這些序列，大小范圍為23-47個(gè)堿基對(duì)。這些重復(fù)序列（repeat）被相似長(zhǎng)度的間隔子（spacer）隔開。
? ? ??
Repeat是細(xì)菌固有序列，能夠同時(shí)結(jié)合CRISPR相關(guān)性（Cas）蛋白和spacer序列，而spacer則是細(xì)菌（或是其祖先）感染過(guò)的病毒序列。一旦病毒感染發(fā)生，絕大多數(shù)的細(xì)菌死亡，極少部分的細(xì)菌由于其基因變異得以生存。這些細(xì)菌中的一部分，將病毒的DNA序列切割后，插入repeat區(qū)域中，形成spacer，從而獲得類似高等生物“免疫記憶”的能力。當(dāng)細(xì)菌被病毒再次攻擊時(shí)，這些間隔序列會(huì)從整個(gè)序列排列中被轉(zhuǎn)錄出來(lái)，切割成為成熟的crRNA對(duì)Cas蛋白的復(fù)合物進(jìn)行引導(dǎo)，切割病毒的核酸分子中的間隔序列前體（protospacer）。
?
crRNA招募效應(yīng)蛋白的組成將其分為兩級(jí)，1級(jí)CRISPR系統(tǒng)利用多個(gè)Cas蛋白與crRNA形成效應(yīng)復(fù)合物，2級(jí)CRISPR系統(tǒng)利用單個(gè)大Cas蛋白與crRNA形成效應(yīng)復(fù)合物。
?
需要注意的是，只有當(dāng)間隔序列前體的兩側(cè)是由間隔序列前體臨近基序（PAM）組成時(shí)才會(huì)發(fā)生切割，而在間隔序列兩側(cè)沒有PAMs時(shí)不會(huì)發(fā)生。不同的Cas蛋白識(shí)別不同的PAM序列，有研究表明產(chǎn)膿型鏈球菌（Streptococcuspyogenes）中的SpCas9對(duì)病毒基因組的切割作用需要在病毒性序列作用目標(biāo)下游有一個(gè)5'-NGG-3'間隔序列前體臨近基序（PAM）序列的存在。
?
總而言之，CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。整個(gè)過(guò)程有點(diǎn)類似慕容復(fù)的“以彼之道，還施彼身”，你用DNA對(duì)付我，我用你的DNA把你殺死。
二、CRISPR-Cas臨床診斷優(yōu)勢(shì)凸顯
?
利用CRISPR酶的酶切特性，分子診斷技術(shù)有望在兩個(gè)方向?qū)崿F(xiàn)突破：一是對(duì)多種病原體實(shí)現(xiàn)高靈敏度定量檢測(cè)；二是快速診斷，減少檢測(cè)時(shí)間。Gootenberg等開發(fā)了一種改進(jìn)的核酸檢測(cè)技術(shù)，用于多重定量和高度靈敏的檢測(cè)，并結(jié)合了側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行可視化。Myhrvold等通過(guò)添加樣品制備方案，以快速檢測(cè)臨床樣品中的特定病原體。
?
2016年，國(guó)內(nèi)最有名的張鋒實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Cas13在單個(gè)crRNA的引導(dǎo)下，能夠切割ssRNA或mRNA（類似于RNA干擾），實(shí)現(xiàn)基因敲低方面的應(yīng)用。同時(shí)，Cas13還附帶非特異性的ssRNA切割功能。其開發(fā)的SHERLOCK v1版方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬滅的ssRNA報(bào)告基團(tuán) ，通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增步驟來(lái)快速檢測(cè)單個(gè)DNA或RNA分子。
?
2018年，張鋒實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)的成果用簡(jiǎn)單的紙帶（paper strip），以展示基因特征（genetic signatures）的測(cè)試結(jié)果。將紙帶浸入處理過(guò)的樣本后，會(huì)出現(xiàn)一條線，指示著目標(biāo)分子是否被檢測(cè)到了。通過(guò)對(duì)CRISPR酶學(xué)的表征和應(yīng)用開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了更快速、更靈敏的檢測(cè)：1、檢測(cè)下限低至2 attomolar；2、通過(guò)將Cas13與Csm6（一種與CRISPR相關(guān)的輔助酶）結(jié)合，使信號(hào)靈敏度提高3.5倍；3、SHERLOCK v2可以通過(guò)側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)登革熱或Zika病毒單鏈RNA以及患者液體活檢樣品中的突變，突出了其作為核酸的可復(fù)用，便攜式，快速和定量檢測(cè)平臺(tái)的潛力。
? ? ? ?
? ?
2018年4月，另一個(gè)知名團(tuán)隊(duì)Jennifer Doudna教授發(fā)現(xiàn)Cas12酶家族在gRNA的引導(dǎo)下與目標(biāo)序列結(jié)合以后，便會(huì)切換為激活狀態(tài)切割體系內(nèi)其它的單鏈DNA（如含有報(bào)告基因的單鏈底物）。Cas12a這一特點(diǎn)可被用于分子診斷領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤基因或特定病原體的檢測(cè)。Doudna教授將Cas12a靶向切割單鏈DNA的特性與重組聚合酶擴(kuò)增RPA技術(shù)聯(lián)合起。當(dāng)加熱到體溫時(shí)，RPA會(huì)快速增加目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)，使Cas12a更容易找到并切割它，然后任意切割附近單鏈DNA，從而讓報(bào)告分子發(fā)出熒光。
? ? ? ?
Doudna教授為了分析DETECTR方法的特異性和靈敏度，測(cè)試了25種人類肛門拭子的DNA提取物，這些樣本先前已通過(guò)基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的方法進(jìn)行過(guò)HPV感染分析。在1小時(shí)內(nèi)，DETECTR準(zhǔn)確地鑒定了包含HPV類型異質(zhì)混合物的患者樣品中的HPV16（25/25）和HPV18（23/25），PCR結(jié)果與DETECTR熒光信號(hào)之間具有良好的相關(guān)性。這些結(jié)果證明了一種新的基于CRISPR的診斷平臺(tái)，類似于使用CRISPR-Cas13a用于RNA檢測(cè)的平臺(tái)，并表明DETECTR原則上可以以高靈敏度和特異性檢測(cè)任何DNA序列。
?
? ? ?
較為明顯的是，RT-PCR的檢測(cè)一般要等幾個(gè)小時(shí)，還需要使用特殊設(shè)備、進(jìn)行冷熱循環(huán)；與之相比，DETECTR以及SHERLOCK v2技術(shù)只有兩個(gè)固定的操作溫度，大約45分鐘后，就能像家用驗(yàn)孕測(cè)試一樣，在可視化讀出條上讀取結(jié)果。具有良好的應(yīng)用前景。
?
三、CRISPR與罕見基因病療法
?
除了在臨床分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用，CRISPR基因編輯技術(shù)已應(yīng)用于白血病、血友病等遺傳病的基因療法（gene therapy）取得多項(xiàng)進(jìn)展。基因治療是將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，達(dá)到治療目的。目的基因轉(zhuǎn)移方法可分為病毒方法和非病毒方法兩大類。由于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能作為向?qū)О涯康腄NA送達(dá)靶位置，避免對(duì)正常功能基因的干擾，可減少不必要的突變風(fēng)險(xiǎn)。目前這項(xiàng)面臨的主要挑戰(zhàn)是將它送到體內(nèi)的正確位置。
?
市場(chǎng)上主要的專注于基因編輯的3家上市公司為Editas Medicine、 CRISPR Therapeutics和Intellia Therapeutics，多家創(chuàng)業(yè)公司融資到B輪。但CRISPR基因編輯的發(fā)展并非一帆風(fēng)順。2018年5月，CRISPR Therapeutics公司與Vertex Pharmaceuticals的合作遭遇挫折，其共同研發(fā)的針對(duì)鐮刀型貧血癥的基因療法CTX001在FDA的IND審查中受到臨床試驗(yàn)暫停。近日獲得進(jìn)展，于 5 月 11 日宣布，（FDA）授予 CTX001 再生醫(yī)學(xué)高級(jí)療法（RMAT）資格，CTX001 是基于CRISPR研發(fā)出的一種研究性，自體基因編輯的造血干細(xì)胞療法，將用于治療嚴(yán)重的嚴(yán)重鐮刀型細(xì)胞貧血?。⊿CD）和輸血依賴性β地中海貧血（TDT）。
? ? ?? ? ??
主要問(wèn)題是由于目前廣泛用于基因組編輯的CRISPR / Cas9方法涉及切割兩條DNA鏈，在目標(biāo)DNA序列中形成雙鏈斷裂。當(dāng)用于糾正單個(gè)核苷酸時(shí)，會(huì)經(jīng)常在目標(biāo)位置引入隨機(jī)插入或缺失（統(tǒng)稱為indels）。消息一出，3家上市公司的股價(jià)均受到嚴(yán)重挫折。為了解決這個(gè)問(wèn)題，David Liu及其同事的研究對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行了修飾，使其不再切割兩條DNA鏈，但仍可以與目標(biāo)DNA序列結(jié)合。通過(guò)將堿基修飾酶（APOBEC1）連接到Cas9，能夠?qū)奏ぃ–）直接轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），尿嘧啶（U）與胸腺嘧啶（T）形成堿基對(duì)。
?
結(jié)語(yǔ)
我們非?？上驳乜吹剑珻RISPR技術(shù)在臨床感染診斷，液體活檢和基因治療方面都取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。如何能讓CRISPR技術(shù)這把神奇的基因剪刀手變得準(zhǔn)確率更高、編輯更有效，是CRISPR技術(shù)發(fā)展的主要方向。
-
焦點(diǎn)事件
-
焦點(diǎn)事件
