DNA酶切及凝膠電泳實驗原理、儀器試劑和操作步驟
【實驗原理】
DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA
分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA 分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA 片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA
分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系.。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA,
也可以分離相對分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實驗提取的pUC19
質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular
DNA，簡稱CCCDNA)，開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂，（open circular DNA,
簡稱OCDNA）,線狀質(zhì)粒DNA ，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2 條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA，簡稱L
DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3 條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA
泳動最快，其次為線狀DNA，開環(huán)質(zhì)粒DNA。
【實驗材料】
λDNA: 購買或自行提取純化; 重組pBS 質(zhì)料或pUC19 質(zhì)粒; EcoRI 酶及其酶切緩沖液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖(Agarose): 進口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。
【實驗儀器】
水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機, 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機及其附件。
【實驗試劑】
1、 5×TBE電泳緩沖液：配方見實驗一。
2、 6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
3、 溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB 配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。
【實驗步驟】
1、 DNA酶切反應(yīng)
1） 將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf 管(最好0.5ml)編號,用微量移液槍分別加入DNA
1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl
酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實驗成敗的關(guān)鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
2） 混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf 管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫2-3 小時,使酶切反應(yīng)完全。
3） 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>2、DNA分子量標準的制備
采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標準。λDNA 為長度約50kb 的雙鏈DNA
分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6,
4.4, 2.3,2.0, 0.56 和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6 個片段,長度 分別為21.2, 7.4, 5.8,5.6,
4.9和2.5kb。
3、瓊脂糖凝膠的制備
1） 取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀釋緩沖液,待用。
2） 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml 錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。
加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。
3） 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB
加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml 的EB
溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE
稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
4） 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA
含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip
頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
5） 電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
6） 染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7） 觀察和拍照：在波長為254nm
的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應(yīng)戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。
經(jīng)照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
8） DNA 分子量標準曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點,用卡尺測量λDNA
的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標,以遷移距離為橫坐標,在坐標紙上繪出連結(jié)各點的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
9） DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA
分子量標準曲線上查出相應(yīng)的對數(shù)值,進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數(shù)坐標紙來繪制標準曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預(yù)計的遷移距離。
10） DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對照DNA 酶切片段大小的數(shù)據(jù)進行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。
[注意]
1）酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。
2）酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時完全降解1mg lDNA 的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA
不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
3）市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10 之下，否則，酶活性將受影響。
4） 觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA 分子有切割作用。從膠上回收DNA 時,應(yīng)盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
5） EB 是強誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應(yīng)戴手套,并且不要把EB 灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
6） 當(dāng)EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時,可將膠放入蒸餾水沖泡,30 分鐘后再觀察。
