質(zhì)粒DNA的酶切原理和操作步驟
1．目的
學(xué)會用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。
2．原理
II型限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識別位點處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認和分離酶切片段。
3．器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴。
4．試劑
Pinpoint?xa-3質(zhì)粒，EcoR V，BamH I，內(nèi)切酶緩沖液（10×），10×電泳加樣緩沖液，熒光染料。
5．實驗準備
配制TAE電泳緩沖液（50′儲存液），10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。
6．操作步驟
（1）混合下列溶液于一個無菌的1.5ml微量離心管中：
Pinpoint?xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl
10×酶切緩沖液（用EcoRV的緩沖液） 2 μl
ddH2O 30 μl
EcoRV 1μl
BamHI 1μl
總體積 40μl
（2）先準備一個冰盒并放入一定量的冰塊。從-20℃冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。
（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性內(nèi)切酶。
（4）在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜?。?，輕輕震動微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1~3 h（一般是 37℃）。
（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物）對比電泳，以確認切下的片斷是否為自己想要的片斷。
（6）酶切后的質(zhì)粒可以回收備用（見實驗六：從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段）。
（7）清理桌面垃圾，清洗實驗儀器。撰寫實驗報告。
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