蛋白質(zhì)免疫印跡實驗制備分離膠、積層膠
制備分離膠、積層膠
1）所需器材：制冰機、制膠槽、Teflon梳子、小燒杯、手套、大冰盒、去離子水、30%聚BXXA溶液、1.5mol/L的Tris-cl（PH值8.8）、1.0mol/L的Tris-cl（PH值6.8）、10%SDS（十二烷基磺酸鈉）、10%AP（過硫酸銨）、TEMED（四甲基乙二胺）、移液槍、吸頭。
2）操作步驟
a.制冰機制冰；
b.將制膠槽雙層玻片裝進制膠槽小夾子（雙層玻片左右方及下方要注意對齊），濾紙吸干雙層玻片中殘留液體，再將小夾子裝進制膠槽大夾子，平放（制膠槽所放平面一定要水平）；
c.將大冰盒裝上冰，戴好手套，取出保存于4℃冰箱的30%聚BXXA溶液、1.5mol/L的Tris-Hcl(PH值8.8)、1.0mol/L的Tris-cl(PH值6.8)、TEMED、保存于-20℃冰箱的10%AP，備好存放于常溫的去離子水、10%SDS，根據(jù)所需配制的分離膠濃度及量，依次往小燒杯中加不同體積的去離子水、30%聚BXXA溶液、1.5mol/L的Tris-Hcl、10%SDS、10%AP、TEMED。加入TEMED后，立即用移液槍吸頭混勻小燒杯膠液，倒入制膠槽雙層玻璃中（留梳齒+1cm長以備加積層膠），輕輕抖動幾下制膠槽使液面平齊，再用去離子水（當BXXA濃度〈8%時也可采用0.1%的SDS，當BXXA濃度〉10%時也可采用異丁醇）封閉液面以免氧氣擴散進入凝膠抑制聚合反應(yīng)，靜置半小時；
c.待分離膠凝固后（分離膠與去離子水界面可看到一條分離線），根據(jù)所需制備積層膠的濃度和量，往小燒杯中依次加入不同體積的去離子水、30%聚BXXA溶液、1.0mol/L的Tris-cl(PH值6.8)、10%SDS、10%AP，然后先將分離膠上層的去離子水倒去，再用去離子水沖洗去除未聚合的凝膠，濾紙吸凈殘留液體。往小燒杯加入TEMED，立即用移液槍吸頭混勻小燒杯膠液，倒入制膠槽雙層玻璃中分離膠上方，小心插入梳子，注意不能留有汽泡（操作時先使梳孔下緣接觸液面，再左右兩邊平衡緩慢插入梳子），靜置半小時待積層膠凝固（凝固后梳齒邊緣可看到分離線）。
