體外診斷IVD-簡單了解分子診斷之FISH技術(shù)（T15）
分子診斷的主要技術(shù)有核酸分子雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、基因檢測技術(shù)和生物芯片技術(shù)（gene chip）。
熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）：是一種應(yīng)用非放射性熒光物質(zhì)依靠核酸探針雜交原理在核中或染色體上顯示DNA序列位置的方法。
FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成帶顏色的雜交信號(hào)，從而在顯微鏡下進(jìn)行目的基因的定位檢測觀察。
一、FISH流程
1、 根據(jù)目的基因信息設(shè)計(jì)合成帶標(biāo)記的特異性探針；
2、 待測樣本制備（組織切片，細(xì)胞爬片）；
3、（1）探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。
（2）標(biāo)本變性：將標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h；玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min；立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
4、雜交、將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃過夜（約15～17h）。
5、顯微鏡下觀察信號(hào)，結(jié)果分析。
二、FISH技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)
? ?優(yōu)點(diǎn):
?? ?1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；
? ?2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；
? ?3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；
? ?4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；
? ?5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；
? ?缺點(diǎn)：
? ?1、不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。
三、FISH技術(shù)臨床運(yùn)用
? 1、疾病診斷
?? ?1）地中海貧血基因檢測：定性檢測地中海貧血基因突變。
? ?2）BCR/ABL融合基因檢測：檢測白血病骨髓細(xì)胞中BCR/ABL融合基因的存在。
? 3）AML1/ETO融合基因檢測：定性檢測白血病患者骨髓樣本中的AML1/ETO融合基因，僅用于初治病人的分子分型的輔助診斷。
? ?4）PML/RARA融合基因檢測：定性檢測白血病患者骨髓樣本中的PML/RARA融合基因，僅用于初治病人的分子分型的輔助診斷。
? ?5）肝炎病毒基因分型檢測：乙型肝炎和丙型肝炎分型檢測
? ?6）解脲脲原體基因分型檢測：定性對(duì)人泌尿生殖道樣本中解脲脲原體的分型檢測。
? ?7）人乳頭瘤病毒(23個(gè)型)基因分型檢測：定性檢測尿道分泌物、宮頸脫落細(xì)胞、疣體細(xì)胞等樣本中人乳頭瘤病毒(HPV)基因型別。
? ?8）新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測：心冠病毒檢測。
? ?9）分枝桿菌菌種鑒定基因檢測：定性檢測人痰液樣本中的如下所示種（群）的分枝桿菌。
? ?10）淋球菌/沙眼衣原體/解脲脲原體檢測：檢測生殖道分泌物、宮頸細(xì)胞樣本中淋球菌、沙眼衣原體、解脲脲原體DNA的存在。
2、用藥指導(dǎo)
? ?1）CYP3A5（A6986G）基因檢測：人外周血基因組DNA 中CYP3A5基因6986位點(diǎn)基因型。用于評(píng)估免疫抑制劑（如環(huán)孢素、他克莫司等藥物）臨床療效和毒副作用和指導(dǎo)免疫抑制劑的個(gè)體化用藥。
? ?2）CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測：華法林（房顫、血栓、肺栓塞等）個(gè)體化用藥指導(dǎo)。
3、產(chǎn)前診斷?
?? ?1）MTHFR (C677T)基因檢測試；定性檢測從人外周血提取的DNA中5，10亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677位單核苷酸突變。預(yù)防新生兒出生缺陷、心腦血管等疾病的發(fā)生。
? ? 2）產(chǎn)前染色體數(shù)目檢測：檢測羊水細(xì)胞中13號(hào)、18號(hào)、21號(hào)、X及Y染色體的數(shù)目。
4、在實(shí)體瘤中的應(yīng)用
? ?1）EGFR基因檢測試：定性檢測確診為非小細(xì)胞型肺癌患者的石蠟包埋肺癌組織切片中的EGFR基因擴(kuò)增。
? ?2）ALK基因重排檢測試：用于檢測臨床確診非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者石蠟包埋組織切片中ALK基因重排情況.
?? ?3）HER-2/neu基因檢測試：定性檢測確診為乳腺癌患者的石蠟包埋乳腺癌組織切片中的HER-2/neu基因（17q12）擴(kuò)增。
? ?4）TOP2A基因異常檢測：用于檢測臨床確診乳腺癌患者的10%中性福爾馬林固定石蠟包埋組織切片中TOP2A基因異常情況
? ?5）人類K-ras基因突變檢測：用于體外定性檢測臨床確診的結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌患者石蠟包埋組織樣本提取的DNA樣本中K-ras基因外顯子2和3的8種基因突變。
?? ?6）膀胱癌細(xì)胞染色體及基因異常檢測：檢測尿液中脫落細(xì)胞的3號(hào)、7號(hào)、17號(hào)染色體的數(shù)目及9號(hào)染色體上p16基因位點(diǎn)的數(shù)目。
四、自動(dòng)核酸分子雜交儀
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焦點(diǎn)事件
