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血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)誤差的來(lái)源及解決方案—自動(dòng)化計(jì)數(shù)

2020.6.15

引言

血球計(jì)數(shù)板一直是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞計(jì)數(shù)的金牌標(biāo)準(zhǔn)。自從18世紀(jì)在法國(guó)第一次被用于分析病人的血液樣本，血球計(jì)數(shù)板在過(guò)去幾百年中已經(jīng)得到一系列的重大發(fā)展，相比以前計(jì)數(shù)更為精確、使用更為簡(jiǎn)單，并最終形成了今天我們使用的樣子?，F(xiàn)在血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)仍然是所有細(xì)胞學(xué)研究的一個(gè)組成部分，然而其計(jì)數(shù)存在的問(wèn)題由于自身固有的設(shè)計(jì)和使用方法并沒有隨著時(shí)間而消失。我們?cè)谶@里將要列出造成血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)誤差的來(lái)源，并將討論自動(dòng)化計(jì)數(shù)是如何消除這些問(wèn)題的。

血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)誤差的來(lái)源

1. 人工失誤(混勻、加樣、稀釋、計(jì)算錯(cuò)誤以及人工操作誤差)

a. 在對(duì)5個(gè)操作者的觀察中，操作錯(cuò)誤和隨機(jī)錯(cuò)誤分別占3.12%和7.8%^[3]。

b. James M. Ramsey做了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，衡量取樣區(qū)和稀釋系數(shù)如何影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

他測(cè)試了3個(gè)取樣區(qū)面積(18, 9和4 mm²)及兩個(gè)稀釋系數(shù)(1:100 和 1:25)。取樣面積減小時(shí)CVs值是升高的，稀釋倍數(shù)的升高會(huì)降低CVs^[4]。

?c. Bane 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同一個(gè)操作者去對(duì)同樣的兩份精液樣品計(jì)數(shù)時(shí)，計(jì)數(shù)結(jié)果的差異55%歸因于取樣和移液?jiǎn)栴}， 45%歸因于計(jì)數(shù)室和細(xì)胞計(jì)數(shù)問(wèn)題 [5]。 Freund和Carol 展開的另外一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，不同操作者之間的計(jì)數(shù)差異能高達(dá)52%，而同一個(gè)操作者的計(jì)數(shù)差異為20%^[5]。

2. 多次計(jì)數(shù)以保證結(jié)果準(zhǔn)確性的必要性

a. 1907年， John C. DaCosta 聲明，為了得到精確的計(jì)數(shù)結(jié)果，很有必要取血液樣品中的多滴血液分別進(jìn)行計(jì)數(shù)^[1].

b. Nielsen, Smyth和Greenfield得出結(jié)論，為了得到10%, 15%和 20%的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性, ，必需的樣品數(shù)分別為7份, 3份和2份,每份樣品中分別包含180個(gè), 200個(gè)和125個(gè)細(xì)胞^[6]。

c. 1881年， Lyon 和Thoma推測(cè)血球計(jì)數(shù)板的標(biāo)準(zhǔn)誤差為 ,其中n即計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)目；

d. 1907年, William Sealy以“學(xué)生”的名義發(fā)布了他計(jì)數(shù)釀啤酒師的酵母的工作，他特地通過(guò)實(shí)驗(yàn)和數(shù)學(xué)模型計(jì)算了計(jì)數(shù)誤差，公式也為^[7,8]。

3. 細(xì)胞均勻分布的要求

a. 1912年， James C. Todd將細(xì)胞分布不均勻列為計(jì)數(shù)誤差的問(wèn)題來(lái)源^[1]。

b. 學(xué)生也說(shuō)有兩項(xiàng)主要的計(jì)數(shù)誤差來(lái)源，一為吸取的酵母樣品不能夠代表原液的濃度，另一個(gè)是隨機(jī)取樣時(shí)細(xì)胞在計(jì)數(shù)區(qū)域分布不均勻^[7,8]。

c. 1947年, 一篇文章提到血球計(jì)數(shù)板中的細(xì)胞濃度分布不均勻問(wèn)題。最初的結(jié)果顯示，離進(jìn)樣口最近和最遠(yuǎn)區(qū)域的濃度分別比平均濃度低3.5%和高3.5%^[9]。

4. 儀器及材料差異(柵格，深度，蓋玻片，緩沖液類型以及移液器)

a. 結(jié)果顯示計(jì)數(shù)室的計(jì)數(shù)誤差和移液器（CV%）造成的計(jì)數(shù)誤差分別在大約4.6% 和4.7%^[10]。

b. 在一項(xiàng)5個(gè)計(jì)數(shù)人員的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，移液器和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器造成的誤差分別為9.46% 和4.26%^[3]。

c. 1961年, Sanders和Skerry得出結(jié)論，蓋玻片的位置能造成7.6%的計(jì)數(shù)差異^[11]。

d. 在關(guān)于不同稀釋步驟的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，隨著稀釋步驟的增加，變異系數(shù)升高，每個(gè)血細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)的誤差如下： Bürker-Türk (BT) (7.7%-12%), Thoma (6.6%-14.1%), Makler (19.8%-23.6%)^[12]。

解決血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)問(wèn)題

隨著新技術(shù)的發(fā)展，如計(jì)算機(jī)技術(shù)、自動(dòng)化軟件、光學(xué)鏡片、熒光染料、精密制造，以及現(xiàn)代技術(shù)如熒光顯微技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、圖像細(xì)胞術(shù)，自動(dòng)化已經(jīng)解決了血球計(jì)數(shù)板存在的許多問(wèn)題^[13-25]。

自動(dòng)化計(jì)數(shù)解決：

人工操作誤差 - 為了解決這個(gè)問(wèn)題，自動(dòng)化和機(jī)器人技術(shù)能夠代替人工的樣品操作和計(jì)數(shù)操作。.

加樣誤差 - 取樣區(qū)越多、計(jì)數(shù)細(xì)胞越多，隨機(jī)誤差越小，但是需要時(shí)間越多。通過(guò)應(yīng)用自動(dòng)取樣或者成像技術(shù)，成千上百萬(wàn)的細(xì)胞能在很短時(shí)間內(nèi)被分析，提高了效率，并把分析中的隨機(jī)誤差降到最低。

移液和稀釋誤差 - 這些取決于操作者的操作經(jīng)驗(yàn)。通過(guò)采用自動(dòng)加樣器或者自動(dòng)液流系統(tǒng)，這個(gè)誤差可以被降到最低^[26]。

材料誤差 - 計(jì)數(shù)室的誤差是由于不同品牌的血球計(jì)數(shù)板或者同一品牌不同批次間的差異造成的。這也可以通過(guò)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的選擇，請(qǐng)查閱http://dakewe.com/product/view/id-71.html或百度文庫(kù)http://wenku.baidu.com/view/f13faf4916fc700abb68fc54.html 中《細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的選擇》一文）增加取樣量及減小隨機(jī)誤差來(lái)解決。

細(xì)胞分布不均勻 – 血球計(jì)數(shù)板不合適的清洗，或者蓋玻片放置不正確將會(huì)產(chǎn)生誤差。這些可以通過(guò)不使用計(jì)數(shù)室的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來(lái)消除，比如流式細(xì)胞儀。但是細(xì)胞樣品中若是存在細(xì)胞團(tuán)，基于液流計(jì)數(shù)的儀器將很難計(jì)數(shù)，而使用圖像計(jì)數(shù)儀，細(xì)胞團(tuán)可以使用圖像分析算法計(jì)數(shù)聚集的細(xì)胞，這樣可以提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

綜述

血球計(jì)數(shù)板幾百年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)研究中一直都是一個(gè)必備的工具，并且經(jīng)歷了很多的改進(jìn)形成了今天研究者們使用的樣子，然而它仍然會(huì)造成很多不可避免的計(jì)數(shù)誤差。今天，現(xiàn)代化的自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的使用已經(jīng)很大程度上消除了許多出現(xiàn)誤差的來(lái)源，提高了細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和效率。

參閱文獻(xiàn)

1. Davis JD. THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE. Urbana: University of Illinois at Urbana-Champaign; 1995.

2. Verso ML. Some Nineteenth-Century Pioneers of Haematology. Medical History 1971; 15(1): 55-67.

3. Biggs R, Macmillan RL. The Errors of Some Haematological Methods as They Are Used in a Routine Laboratory. Journal of Clinical Pathology 1948; 1: 269-87.

4. Ramsey JM. The Effects of Size of Sampling Area and Dilution on Leucocyte Counts in a Hemocytometer. The Ohio Journal of Science 1969; 69(2): 101-4.

5. Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.

6. Nielsen LK, Smyth GK, Greenfield PF. Hemacytometer Cell Count Distribution: Implications of Non-Poisson Behavior. Biotechnology Progress 1991; 7: 560-3.

7. Student. On the Error of Counting with a Haemacytometer. Biometrika 1907; 5(3): 351-60.

8. Shapiro HM. "Cellular Astronomy" - A Foreseeable Future in Cytometry. Cytometry Part A 2004; 60A:115-24.

9. Hynes M. The Distribution of Leucocytes on the Counting Chamber. Journal of Clinical Pathology 1947;1: 25-9.

10. Berkson J, Magath TB, Hurn M. The Error of Estimate of the Blood Cell Count as Made with the Hemocytometer. American Journal of Physiology 1940; 128: 309-23.

11. Sanders C, Skerry DW. The Distribution of Blood Cells on Haemacytometer Counting Chambers with Special Reference to the Amended British Standards Specification 748 (1958). Journal of Clinical Pathology 1961; 14: 298-304.

12. Christensen P, Stryhn H, Hansen C. Discrepancies in the Determination of Sperm Concentration using Bürker-Türk, Thoma and Makler Counting Chambers. Theriogenology 2005; 63: 992-1003.

13. Al-Rubeai M, Welzenbach K, Lloyd DR, Emery AN. A Rapid Method for Evaluation of Cell Number and Viability by Flow Cytometry. Cytotechnology 1997; 24: 161-8.

14. Fazal SS. A test for a Generalized Poisson Distribution. Biometrical Journal 1977; 19(4): 245-51.

15. Hansen C, Vermeiden T, Vermeiden JPW, Simmet C, Day BC, Feitsma H. Comparison of FACSCount AF system, improved neubauer hemocytometer, Corning 254 photometer, SpermVision, UltiMate and NucleoCounter SP-100 for determination of sperm concentration of boar semen. Theriogenology 2006; 66(9): 2188-94.

16. Despotis GJ, Saleem R, Bigham M, Barnes P. Clinical evaluation of a new, point-of-care hemocytometer. Critical Care Medicine 2000; 28(4): 1185-90.

17. Paulenz H, Grevle IS, Tverdal A, Hofmo PO, Berg KA. Precision of the Coulter(R) Counter for Routine Assessment of Boar-Sperm Concentration in Comparison with the Hemocytometer and Spectrophotometer. Reproduction in Domestic Animals 1995; 30(3): 107-11.

18. Lutz P, Dzik WH. Large-Volume Hemocytometer Chamber for Accurate Counting of White Cells (Wbcs) in Wbc-Reduced Platelets - Validation and Application for Quality-Control of Wbc-Reduced Platelets Prepared by Apheresis and Filtration. Transfusion 1993; 33(5): 409-12.

19. Brecher ME, Harbaugh CA, Pineda AA. Accurate Counting of Low Numbers of Leukocytes - Use of Flow-Cytometry and a Manual Low-Count Chamber. American Journal of Clinical Pathology 1992; 97(6): 872-5.

20. Vachula M, Simpson SJ, Martinson JA, et al. A Flow Cytometric Method for Counting Very Low-Levels of White Cells in Blood and Blood Components. Transfusion 1993; 33(3): 262-7.

21. Szabo SE, Monroe SL, Fiorino S, Bitzan J, Loper K. Evaluation of an Automated Instrument for Viability and Concentration Measurements of Cryopreserved Hematopoietic Cells. Laboratory Hematology 2004; 10: 109-11.

22. Chan LL, Wilkinson AR, Paradis BD, Lai N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence 2012; 22: 1301-11.

23. Chan LL, Zhong X, Qiu J, Li PY, Lin B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom Part A 2011; 79A(7): 507-17.

24. Chan LL-Y, Lai N, Wang E, Smith T, Yang X, Lin B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis 2011; 16(12): 1295-303.

25. Bocker W, Gantenberg HW, Muller WU, Streffer C. Automated cell cycle analysis with fluorescence microscopy and image analysis. Physics in Medicine and Biology 1996; 41(3): 523-37.

26. Macfarlane RG, Payne AM-M, Poole JCF, Tomlinson AH, Wolff HS. An Automatic Apparatus for Counting Red Blood Cells. British Journal of Haemacytology 1959; 5: 1-15.

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