DNA的酶切實(shí)驗(yàn)原理和操作步驟
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>
本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)、了解限制性內(nèi)切酶的特性，學(xué)習(xí)根據(jù)具體目的設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)拿盖畜w系并實(shí)施之。
二、實(shí)驗(yàn)原理
利用限制性內(nèi)切酶切割DNA是DNA重組過程中的關(guān)鍵步驟之一。成功的酶切為后續(xù)工作提供了有效的實(shí)驗(yàn)材料。限制性內(nèi)切酶是細(xì)菌體內(nèi)限制修飾系統(tǒng)內(nèi)部切斷的內(nèi)切酶。根據(jù)限制性內(nèi)切酶的特性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。本實(shí)驗(yàn)使用其中的Ⅱ型酶對DNA分子進(jìn)行切割，并得到粘性末端或平末端。
限制性內(nèi)切酶的活性以酶的活性單位表示，1個酶單位（1Unit）指的是在指定緩沖液中，37℃下反應(yīng)60min,完全酶切1μg的純DNA所用的酶量。
在酶切反應(yīng)中，DNA的純度、緩沖液中的離子強(qiáng)度、Mg2+等因素均可影響反應(yīng)，一般可通過增加酶的用量，延長反應(yīng)時間等措施以達(dá)到完全酶切。
三、材料、試劑及器具
1、材料
（1）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品Puc19
（2）自提質(zhì)粒樣品Puc19
2、試劑
（1）EcoR I及其緩沖液(10U/μg)：
Tris HCL或 KCL;DTT(Dithothreitol)二硫蘇糖醇；BSA（小牛血清蛋白）；Mg2+甘油。
3、器具
恒溫水浴鍋
四、操作步驟
取質(zhì)粒樣品于0.5ml離心管中，按照表39-1加入試劑
↓
混勻；4000rpm離心30s,甩至管底
↓
37℃,保溫2h酶切
↓
65℃，保溫20min使酶失活
↓電泳
用紫外投射儀檢測
↓
-20℃保存待用
表39-1 酶切反應(yīng)成分（單位：μl）
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反應(yīng)1（標(biāo)準(zhǔn)Puc19） 反應(yīng)2（自提Puc19） |
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| DNA樣品 | 10 | 10 |
| 酶切緩沖液 | 1.5 | 1.5 |
| EcoR I | 1.0 | 1.0 |
| 無菌水 | 2.5 | 2.5 |
| 總體積 | 15 | 15 |
五、注意事項(xiàng)
1、酶切反應(yīng)體系依不同的酶、不同的酶切目的而異。
2、37℃保溫一段時間后可取少量樣品電泳檢測。若已達(dá)到酶切目的可結(jié)束反應(yīng)。
3、使用加熱使酶失活應(yīng)視限制性內(nèi)切酶的特性而異；也可使用EDTA使酶失活。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.DNA 相對分子量標(biāo)準(zhǔn)物（marker);
2.pUC19 質(zhì)粒 DNA 經(jīng)EcoRⅠ 完全酶切；
3.pUC19 質(zhì)粒 DNA 經(jīng)EcoRⅠ 部分酶切；
4.自提pUC19 質(zhì)粒 DNA （此效果提得較好，為1帶，以超螺旋質(zhì)粒DNA為主。有時是3條帶，分別為超螺旋質(zhì)粒，線狀質(zhì)粒和開環(huán)質(zhì)粒。還有時結(jié)果為2條帶）
