牛乳中蛋白質(zhì)的提取與鑒定
一、目的
學(xué)習(xí)從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法。
二、原理
牛乳和羊乳中含豐富的蛋白質(zhì)，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在羊乳罩中約占總蛋白量3/4，牛乳中約占總蛋白量的5/6。酪蛋白是一種含磷蛋白的不均一混合物。
蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)pH 溶液中溶解度降底。根據(jù)這個(gè)原理，將牛乳的PH調(diào)整至4.8，即酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，酪蛋白即沉淀出來。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到純的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鑒定。
除去酪蛋白的濾液中，尚含有球蛋白，清蛋白等多種蛋白質(zhì)。
試劑
1、醋酸鈉緩沖液（0.2M pH4.6）。
2、米倫（Millon）試劑:將汞100g 溶于140ml（比重1.42）的濃硝酸中（在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行）。然后加兩倍量的蒸餾水稀釋。
3、95%乙醇
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5、10%NaGl.
6、0.5%NaGO
7、0.1NaON
8、0.2%HC1.
9、飽和氫氧化鈣［Ca（OH）］
10、5%醋酸鉛
三、操作
（一）酪蛋白的制備取新鮮牛乳100ml，放入250 ml 燒杯中加熱至40℃.加入100ml 加熱至同樣溫度的醋酸緩沖液，一邊加一邊搖動(dòng)，并用pH為4.7（用1%NaOH 或10%醋酸進(jìn)行調(diào)整）。冷卻至室溫，繼續(xù)放置5 分鐘,然后用細(xì)紗布或?yàn)V紙過濾。濾液為乳清保留以下做鑒定。過濾所得沉淀物,用少量蒸餾水洗幾次，過濾。將洗凈的沉淀物懸浮在約30ml 乙醇中，
用布氏漏斗抽濾。所得沉淀用乙醇和等量混合液洗滌兩次，抽干。最后用50ml 洗一次并抽干。取出抽干的粉狀物，攤開在表面皿上， 使完全揮發(fā)。稱其干重計(jì)算其產(chǎn)量。
（二）酪蛋白的性質(zhì)鑒定
1.溶解度:取試管6 支,分別加水、10%氯化鈉、0.5%氯化鈉，0.1N 氫氧化鈉、0.2%鹽酸及飽和氫氧化鈣溶液各2ml。于每管中加入少量酪蛋白。不斷搖蕩，觀察并記錄各管中的酪蛋白溶解度。
2、米倫反應(yīng)1：取酪蛋白少許，放置于試管中。加入1ml 蒸餾水，再加入米論試劑10 滴，振搖，并徐徐加熱。觀察其顏色變化。
3、含硫（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）測定：取少量酪蛋白溶于1ml0.1N NaOH 溶液中，再加入1-3 滴5%醋酸鉛，加熱煮沸，溶液變?yōu)楹谏?/p>
（三）乳清中可凝固性蛋白質(zhì)的鑒定將制備酪蛋白時(shí)所得的濾液移入燒杯中，徐徐加熱。即出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀。此為乳清中的球蛋白和清蛋白。注附：米倫反應(yīng)是由于蛋白質(zhì)分子中有羥基苯基（-CH-OH）存在之故.一些在3.5 位置上沒有取代基的酚類化合物,例如酪氨酸、酚及廱香酚也呈陽性反應(yīng)。在蛋白質(zhì)分子中，只有酪氨酸才具有羥基苯基，所以蛋白質(zhì)對(duì)米倫試劑起陽性反應(yīng)。
