生物樣品分析方法中基質(zhì)效應(yīng)的考察
LC/MSMS用于生物樣品檢測具有很高的靈敏度和選擇性，但生物樣品的基質(zhì)干擾很大，基質(zhì)組分有可能會(huì)干擾待測組分的質(zhì)譜離子化效率，產(chǎn)生離子增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。使用MRM模式檢測的時(shí)候，色譜圖并不能反映出基質(zhì)干擾對(duì)待測組分檢測的影響，因此優(yōu)化色譜條件時(shí)，通過直觀的色譜圖并不能很好地考察到基質(zhì)效應(yīng)的影響，如果分析方法建立的時(shí)候沒有很好地考察基質(zhì)效應(yīng)，會(huì)對(duì)后續(xù)分析方法的重現(xiàn)性、線性范圍和耐受的樣品量都會(huì)有很大影響。
1.基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)方法：
文獻(xiàn)中評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有兩種：
（1）空白基質(zhì)處理后添加待測成分(post—extracted addition) ：這種方法是在經(jīng)前處理的空白樣品基質(zhì)中添加待測成分，與用流動(dòng)相配制的等濃度的待測成分純?nèi)芤涸谙嗤V條件下分別進(jìn)樣，兩者響應(yīng)信號(hào)的比值，即可得到待測成分在該分析條件下的基質(zhì)效應(yīng)大小 。其計(jì)算公式如下：
ME=A/B*100%
A ： 在經(jīng)過前處理的空白樣品基質(zhì)中添加已知濃度待測成分的響應(yīng)； B：等濃度待測成分純?nèi)芤旱捻憫?yīng)。
（2）柱后輸注待測成分(post—column infusion )：這種方法是進(jìn)樣經(jīng)前處理的空白基質(zhì)樣品時(shí)，在色譜柱之后、質(zhì)譜離子源之前用一恒流泵輸注適當(dāng)濃度的待測成分溶液，與柱后的流出液混合后進(jìn)入質(zhì)譜。這樣可以很直觀地動(dòng)態(tài)觀察在整個(gè)色譜分析過程中基質(zhì)對(duì)待測成分響應(yīng)的影響。該法的優(yōu)點(diǎn)是可以方便地考察評(píng)價(jià)不同樣品處理方法，流動(dòng)相添加物對(duì)響應(yīng)的影響， 同時(shí)更有利于調(diào)整流動(dòng)相洗脫程序和選擇合適的色譜柱。
2方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則中基質(zhì)效應(yīng)的考察:
2015版中國藥典9012原則里對(duì)采用質(zhì)譜方法時(shí)是需要考察基質(zhì)效應(yīng)的。要求使用至少6批來自不同供體的空白基質(zhì),不應(yīng)使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得,則使用少于6批基質(zhì),但應(yīng)該說明理由。
藥典中建議使用的是對(duì)于每批基質(zhì),應(yīng)該通過計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積(由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標(biāo)測得)，與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積(分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤?/span>)比值，計(jì)算每一分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。從6批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于15%。該測定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進(jìn)行。
ME=(A/B)/(AIS/BIS)*100%
A :在經(jīng)過前處理的空白樣品基質(zhì)中添加已知濃度待測成分的響應(yīng)；B:等濃度待測成分純?nèi)芤旱捻憫?yīng);IS:內(nèi)標(biāo)
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除正?；|(zhì)外,還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng),例如溶血的或高血脂的血漿樣品等。
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3 減少基質(zhì)效應(yīng)的方法
（1）.優(yōu)化前處理方法和改善色譜分離條件：
由于基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是由與待測成分同時(shí)進(jìn)入離子源的基質(zhì)成分造成的，因此通過改進(jìn)樣品的前處理過程，盡量除去樣品中的基質(zhì)干擾成分，可顯著地降低基質(zhì)效應(yīng)。使用液液萃取、固相萃取等前處理方式會(huì)比蛋白沉淀方式更能降低基質(zhì)效應(yīng)。
采用合適的色譜分離技術(shù)，使待測成分與基質(zhì)干擾組分分離，避免干擾組分與待測組分同時(shí)進(jìn)入離子源，也能有效地減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。一般來說，使待測成分峰后移，可以有效地避免在溶劑前沿洗脫的極性基質(zhì)成分的影響。但同時(shí)應(yīng)考慮色譜峰后延可能會(huì)使待測組分峰展寬及靈敏度下降。
（2）.適當(dāng)添加改性劑來增強(qiáng)待測組分的響應(yīng)或抑制基質(zhì)組分的響應(yīng)：
適當(dāng)?shù)靥砑有└男詣┛梢蕴岣叽郎y物的響應(yīng)，如甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨等，同時(shí)也可以改善色譜峰形。
（3）.降低流速來提高離子化效率：
使用較低流速，在LC／MS 中，尤其在ESI模式中，流速大意味著同時(shí)進(jìn)入離子源的化合物也增多。需要同時(shí)離子化的化合物增多，加劇了待測成分與基質(zhì)成分在電離過程的競爭，從而使待測成分的響應(yīng)降低。此外，在低流速下可產(chǎn)生較細(xì)的霧滴，而使霧滴的總表面積增加，待測成分與基質(zhì)成分在表面積的競爭減少，從而有利于產(chǎn)生氣相離子，提高待測成分的信號(hào)強(qiáng)度。
和其他質(zhì)譜離子源不同，ESI的表觀行為有如濃度型檢測器，其響應(yīng)與流動(dòng)相中待測成分的濃度成正 比。在流速較高的情況下，采用柱后分流，可減少進(jìn)入ESI離子源的流量、降低基質(zhì)效應(yīng)、提高待測成分的信號(hào)強(qiáng)度和儀器靈敏度.
（4）.選擇合適的內(nèi)標(biāo)：
內(nèi)標(biāo)一般選用與待測成分結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)相近的化合物。其中，穩(wěn)定同位素標(biāo)記物是最理想的選擇，因?yàn)槠淇梢阅M待測成分的提取和色譜、質(zhì)譜行為，和待測成分有一致的保留時(shí)間，受基質(zhì)成分的影響也極為相似，但待測成分與其同位素標(biāo)記物在提取行為上也有可能產(chǎn)生極大的差異。另外，使用同位素標(biāo)記物為內(nèi)標(biāo)需闡明存在的同位素純度、避免待測成分和內(nèi)標(biāo)的MS／MS監(jiān)測通道間的“ 交叉干擾”以及同位素穩(wěn)定性(同位素交換現(xiàn)象)等問題。而選擇同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)的另一個(gè)缺點(diǎn)就是其合成比較困難，因而價(jià)格昂貴、難以獲得。當(dāng)難以獲得同位素標(biāo)記物為內(nèi)標(biāo)時(shí)，可以選用待測成分的結(jié)構(gòu)類似物作為第二選擇，2015版藥典中考察的是內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)效應(yīng)。
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