關(guān)于PCR內(nèi)參基因選擇策略
關(guān)于內(nèi)參基因的選擇很多初級(jí)的實(shí)驗(yàn)人員很少會(huì)去思考這個(gè)問題，因?yàn)閿[在面前的只有兩種選擇，β-actin和GAPDH，甚至在很多人長(zhǎng)期的觀念中對(duì)于內(nèi)參的認(rèn)知也僅僅停留在是一個(gè)表達(dá)量相對(duì)較高較穩(wěn)定的看家基因，對(duì)于分子層面相對(duì)表達(dá)量的一個(gè)重要參照而已，至于為什么要選這兩種，還有沒有其他的內(nèi)參，人們的回答往往是“Sorry，I don’t care.”或者“我的前輩就是這樣用的，別的文獻(xiàn)是這樣寫的，有問題嗎？”。
有問題嗎？BioTNT要在這里大聲的疾呼“有，而且是很大的問題?！碑?dāng)人們檢測(cè)某個(gè)基因的表達(dá)降低或者提高得出結(jié)果以后，你并不知道是它本身的表達(dá)量發(fā)生變化，還是因?yàn)闃颖玖看笮』蛘卟僮鲗?dǎo)致RNA的損失等其他原因?qū)е碌谋磉_(dá)量變化，所以這個(gè)時(shí)候需要同時(shí)檢測(cè)另外的基因作為參照。這另外的基因就是內(nèi)參基因。
于是，從我們本身科學(xué)的要求來看，理想的內(nèi)參就會(huì)有這樣幾個(gè)條件，1、表達(dá)量較大；2、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織；3、表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無(wú)關(guān)；4、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響；5、不存在假基因，以避免基因組 DNA 的污染擴(kuò)增。請(qǐng)注意這是理想的內(nèi)參，讓我們來一個(gè)一個(gè)看看我們常見的經(jīng)典內(nèi)參是不是真的夠理想呢？
第一，是β-actin，即β肌動(dòng)蛋白。我們先要來看看actin是什么，所謂的actin肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白，大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括α-skeletal （骨骼）、cardiac （心）、smooth （平滑）muscle actin和γ-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括 β -actin和γ-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是α-cardiac muscle actin。顯而易見，如果我的研究模型是心或者是骨骼，β-actin作為內(nèi)參顯然就不合適。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，β-actin的mRNA的表達(dá)水平增加，很明顯這與腫瘤細(xì)胞易增殖，會(huì)遷移的特性從理論上也對(duì)的起來，BioTNT在平時(shí)接觸以腫瘤組織為樣本的實(shí)驗(yàn)中，雖然已經(jīng)控制了組織濕重，但是正常組和腫瘤組間的β-actin的表達(dá)差異還是相當(dāng)大的，這又進(jìn)一步限制了β-actin的適用范圍，另外β-actin也是為數(shù)不多的幾個(gè)要注意假基因污染的內(nèi)參。隨著對(duì)β-actin研究的深入，過去常被認(rèn)為是表達(dá)穩(wěn)定，表達(dá)量高的β肌動(dòng)蛋白實(shí)際上并不那么穩(wěn)定，包括一些肝組織的內(nèi)臟組織中的β-actin也不是內(nèi)參的最佳選擇。
第二，是GAPDH。我們?cè)賮砜聪翯APDH，3-磷酸甘油醛脫氫酶，糖酵解過程中的一種反應(yīng)酶，也是幾乎在所有組織細(xì)胞中高表達(dá)，且表達(dá)量幾乎不變，是細(xì)胞代謝途徑中不可或缺的一個(gè)基因，但也正是因?yàn)槠湓谔墙徒庵邪缪莶豢珊鲆暤慕巧?，?dǎo)致了其被在牽涉到該代謝過程的所有內(nèi)源和外源因素影響是及其明顯的，比如，最最典型的細(xì)胞分裂時(shí)期的細(xì)胞，在不同細(xì)胞周期中GAPDH的表達(dá)呈顯著性變化，因?yàn)橥瑯釉?，迅速分裂增殖的腫瘤細(xì)胞樣本也是很難用GAPDH作為恒定表達(dá)內(nèi)參來使用，還有在相關(guān)外源因素 (例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長(zhǎng)因子等 )刺激下，GAPDH的mRNA表達(dá)水平也不同，這使得GAPDH在某些實(shí)驗(yàn)中還不如β-actin來的穩(wěn)定。
現(xiàn)在，問題就非常明確了，過去我們?cè)浅Ｒ蕾嚨膬纱髢?nèi)參或多或少甚至在某些地方存在著致命的缺陷，比如說腫瘤細(xì)胞的研究，似乎無(wú)法使用任何一種常規(guī)內(nèi)參了，這如何去解決呢？所以BioTNT在這里將例舉20中常用內(nèi)參，并小解其中的一兩個(gè)以作例證。
第三，18S rRNA 和 28S rRNA。由于 rRNA 是由一種不同于mRNA合成的RNA聚合酶所合成。因此rRNA合成的調(diào)節(jié)獨(dú)立于mRNA，在影響mRNA表達(dá)的各種條件下，各種 r RNA水平很少發(fā)生變化，在腫瘤樣本中，用rRNA作為內(nèi)參也許是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。但是rRNA同時(shí)也存在著諸多問題，比如當(dāng)對(duì)已純化mRNA中的目標(biāo)基因進(jìn)行定量時(shí)，rRNA由于在純化過程中被去除而不能用于標(biāo)準(zhǔn)化，再如，從結(jié)構(gòu)上講rRNA不包括poly(A)尾，所以從理論上講在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉(zhuǎn)錄。但是說到這里，BioTNT也曾試過用oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄rRNA，并且能夠成功擴(kuò)增出cDNA，且表達(dá)量并不低，所以BioTNT一直對(duì)于這點(diǎn)有困惑，但是就rRNA本身作為內(nèi)參來使用這點(diǎn)，BioTNT還是小小推薦一下，在遇到樣本量少，樣本質(zhì)量略低等等特殊情況，用rRNA作為內(nèi)參相較還要優(yōu)于β-actin和GAPDH。
第四，其他內(nèi)參。有研究學(xué)者對(duì)67例肝組織研究, 發(fā)現(xiàn)UBC（泛素）和HMBS（膽色素原脫氨酶）對(duì)于肝組織的表達(dá)分析是最佳選擇。在白血病、正常、惡性腫瘤中比較β-actin、β2-MG和PBGD （膽色素原脫氨酶），發(fā)現(xiàn)β2-MG最合適作為內(nèi)參。PRKG1和TBP是適合于在B和T細(xì)胞及其腫瘤中控制RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量……。所以，不同的內(nèi)參基因在不同的條件都有成為合適內(nèi)參的潛能。在一組給定的標(biāo)本或?qū)嶒?yàn)條件中, 平行測(cè)定2個(gè)或以上內(nèi)參的表達(dá)量有助于發(fā)現(xiàn)和減小系統(tǒng)誤差。
綜上所述，當(dāng)我們進(jìn)一步對(duì)不同種類的看家基因進(jìn)行內(nèi)參篩選和研究的時(shí)候就會(huì)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參世界比我們想象的要更為復(fù)雜，當(dāng)我們所研究的對(duì)象從原核到真核，從細(xì)胞到組織，從正常到惡化，所有改變的條件對(duì)于我們內(nèi)參的選擇就是一次篩選，現(xiàn)實(shí)并不存在一種適合所有條件和樣本類型的萬(wàn)能內(nèi)參，BioTNT覺得以雙內(nèi)參或者甚至三內(nèi)參、四內(nèi)參進(jìn)行實(shí)驗(yàn)從理論上講更科學(xué)、更能減小誤差。
就內(nèi)參的進(jìn)一步研究，BioTNT在這里就不一一展開了，實(shí)際上BioTNT在幾年前就已經(jīng)看到有國(guó)外做qPCR時(shí)選取4個(gè)內(nèi)參作平均值得到的數(shù)據(jù)作為調(diào)整內(nèi)參得到更可靠地修正值這一做法，證明已經(jīng)有人意識(shí)到并且去試驗(yàn)這種更科學(xué)的做法，BioTNT雖只是一家之言，但也僅此希望能夠有更多的人能夠在實(shí)驗(yàn)前就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到內(nèi)參的重要性，并提前規(guī)避可能因?yàn)閮?nèi)參選擇不當(dāng)而導(dǎo)致后期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)沒有意義的情況發(fā)生。
另，如果大家有感興趣的，可以查找一些關(guān)于內(nèi)參的大家的綜述或論文。
來源：BioTNT（冠泰生物）
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標(biāo)簽： PCR內(nèi)參基因
