蛋白質(zhì)濃度測定（雙縮脲法）實驗
實驗原理
測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法；比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及 染料結(jié)合法；紫外分光光度法等
雙縮脲(Biuret)法：在堿性溶液中，雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(—CO—NH2)，或與此相似的基團(tuán)[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團(tuán)直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—)，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液比較，經(jīng)計算或查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血清總蛋白質(zhì)含量。
實驗試劑
1．6mol/L氫氧化鈉溶液??
稱取氫氧化鈉(NaOH，優(yōu)級純)240g，用新鮮蒸餾水配制成1L，置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。
2．雙縮脲試劑??
稱取未失結(jié)晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20) 3.0g，溶于500m1新鮮蒸餾水中，加酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g，碘化鉀(KI)5.0g，待安全
溶解后，加入6mol/L氫氧化鈉溶液100ml，最后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩(wěn)定6個月。
3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液?
可用商品血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或定值質(zhì)控血清為標(biāo)準(zhǔn)。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標(biāo)定后，加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃0.5~1.0g/L)，冰凍
保存。
實驗設(shè)備
恒溫水浴箱、722（721）分光光度計、吸管、試管、坐標(biāo)紙
實驗步驟
1. 配制20g／L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液? 如蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為70g／L，則取此液2m1，加入新鮮蒸餾水5ml，混勻即成。
2. 按表操作
| ? ? 加入物（ml） | ??空白管? | ? ?1 | ? ? 2 | ? ? 3 | ? ? 4 | ? ? 5 | ?測定管 |
| 20g/L蛋白標(biāo)準(zhǔn)液 | ? ? ?～?? | ? 0.1 | ? ? 0.2 | ? ?0.3????? | ? ?0.4??? ? | ?? 0.5???? | ? ??～??? |
| 蒸餾水 | ? ? 0.5? | ? ? 0.4 | ? ? 0.3 | ? ?0.2 | ? ? 0.1 | ? ?～?? | ? ? 0.4 |
| 待測樣品液體 | ? ?～ | ? ? ?～? ? | ? ～???? | ? ?～? ? | ? ?～???? | ? ～???? | ? ? 0.1 |
| 雙縮脲試劑?? | ? ?3.0 | ? ?3.0??? | ? ?3.0????? | ? ?3.0??? ? | ?? ?3.0???? | ? ?3.0????? | ? ?3.0??? ? |
| 相當(dāng)血液蛋白質(zhì)（g/L）? ? | ? ??～? ? | ? ? 20 | ? ? 40 | ? ? 60 | ? ? 80 | ? ?100 |
混勻，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用540nm波長比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
1—5為標(biāo)準(zhǔn)曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4. 實驗結(jié)果
根據(jù)測定管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查找相對應(yīng)的總蛋白濃度。
注意事項
1．雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2 形成穩(wěn)定的絡(luò)合銅離子，以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比不低于3：1，加入KI作為抗氧化試劑。
2．雙縮脲試劑要封閉貯存．防止吸收空氣中的二氧化碳。
3．本法各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同，重復(fù)性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點(diǎn)是靈敏度較低。
4．黃疸血清．嚴(yán)重溶血對本法有明顯干擾。
5．本法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線是一條通過原點(diǎn)的直線，在100g/L濃度之內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
