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DNA重組(DNA recombination)技術:DNA序列測定-2

2020.9.14

目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等(1977)提出的酶法(雙脫氧鏈終止法)和Maxam(1977)提出的化學降解法。雖然其原理大相徑庭,但這兩種方法都同樣生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸,每組核苷酸都有共同的起點,卻隨機終止于一種(或多種)特定的殘基,形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度各不相同的寡核苷酸混合物,這些寡核苷酸的長度由這個特定堿基在待測DNA片段上的位置所決定。然后通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)放射自顯影后,從放射自顯影膠片上直接讀出待測DNA上的核苷酸順序。
高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳亦是DNA序列測定技術的重要基礎,可分離僅差一個核苷酸、長度達300~500個核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測定的簡便方法為詳細分析大量基因組的結(jié)構和功能奠定了基礎,時至今日,絕大多數(shù)蛋白質(zhì)氨基酸序列都是根據(jù)基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的。


除傳統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法和化學降解法外,自動化測序?qū)嶋H上已成為當今DNA序列分析的主流。此外,新的測序方法亦在不斷出現(xiàn),如上世紀90年代提出的雜交測序法(sequencing by hybridization,SBH)等。

一、雙脫氧末端終止法測序
㈠ 原理
雙脫氧末端終止法是Sanger等在加減法測序的基礎上發(fā)展而來的。其原理是:利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ,以單鏈DNA為模板,并以與模板事先結(jié)合的寡聚核苷酸為引物,根據(jù)堿基配對原則將脫氧核苷三磷酸(dNTP)底物的5′-磷酸基團與引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯鍵。通過這種磷酸二酯鍵的不斷形成,新的互補DNA得以從5′→3′延伸。Sanger引入了雙脫氧核苷三磷酸(ddTNP)作為鏈終止劑。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一個羥基(2′,3′-ddNTP)(圖7-17),可以通過其5′三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中,但由于缺少3′-OH,不能同后續(xù)的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯鍵。因此,正在增長的DNA鏈不再延伸,使這條鏈的延伸終止于這個異常的核苷酸處。這樣,在4組獨立的酶反應體系中,在4種dNTP混合底物中分別加入4種ddNTP中的一種后,鏈的持續(xù)延伸將與隨機發(fā)生卻十分特異的鏈終止展開競爭,在摻入ddTNP的位置鏈延伸終止。結(jié)果產(chǎn)生4組分別終止于模板鏈的每一個A、每一個C、每個G和每一個T位置上的一系列長度的核苷酸鏈。通過高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,從放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。


脫氧核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸分子結(jié)構
㈡ 模板
有兩種類型的DNA模板可以作為Sanger法測序的模板,即純化的單鏈DNA和經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA。
1.單鏈DNA模板 在一般情況下,可將靶DNA片段克隆于M13mp載體,從重組克隆M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板。這種單鏈模板效果最佳,只要細心掌握模板與引物的最佳比例,有經(jīng)驗的測序人員通過一次末端終止反應,能讀取500個以上的核苷酸序列。


2.經(jīng)熱變性或堿變性的雙鏈DNA模板 盡管采用變性雙鏈DNA作測序模板顯然簡單且方便,但實際上很難獲得單鏈模板那樣的滿意結(jié)果。利用雙鏈質(zhì)粒模板測序,其中有兩個至關重要的因素,即模板的質(zhì)量和聚合酶的種類。用小量制備的質(zhì)粒DNA來測定未知序列的DNA克隆往往因為有污染而并不可取,高純度的質(zhì)粒最好采用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法制備。其次是應采用高質(zhì)量的聚合酶。一次末端終止反應亦可能讀出300核苷酸序列。應該注意的是,適合做雙鏈模板的質(zhì)粒,最好具有較高的拷貝數(shù)并有插入失活的選擇標志,有配套的通用引物結(jié)合區(qū)。最常用的載體系統(tǒng)是pUC系列、pGEM系列及Bluescript系列等。雙鏈模板測序最大的優(yōu)勢是對已知序列DNA的亞克隆進行鑒定,可省略再經(jīng)M13載體亞克隆獲取單鏈模板過程。
㈢ 引物
酶法測序反應中都有一個與模板鏈特定序列互補的合成的寡核苷酸作為DNA合成的引物。不管是將靶DNA片段克隆于M13mp載體獲取的單鏈DNA作模板,還是采用變性雙鏈DNA(如變性質(zhì)粒DNA)模板,都有可以與位于靶DNA側(cè)翼的載體序列相退火的通用引物(universal primer)可用,而不必另行設計與未知DNA序列互補的引物。適合于M13mp系列載體的通用引物一般長15~29個核苷酸,當然這些引物也同樣適用于那些克隆于pUC系列質(zhì)粒的DNA進行雙鏈測序。這些測序用的通用質(zhì)粒及其通用引物可直接從許多廠商購買到。


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