胰蛋白酶的制備及活力的測(cè)定(2)
三、儀器
食品加工機(jī)和高速分散器；研缽；大玻璃漏斗；布氏漏斗；抽濾瓶；紗布；恒溫水浴；紫外分光光度計(jì)；秒表；pH試紙。
操作方法
一、豬胰蛋白酶制備
（一）豬胰蛋白酶原的提取
豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎。
加入2倍體積預(yù)冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃攪拌提取24小時(shí)，四層紗
布過濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，放置3～4小時(shí)后用折迭濾紙過濾得黃色透明濾液（約1.5升）。
加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過
夜后抽濾（擠壓干），得豬胰蛋白酶原粗制品。
（二）胰蛋白酶原激活
向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積（按餅重計(jì)）冷的蒸餾水，使濾餅溶
解，得胰蛋白酶原溶液。將研細(xì)的固體無水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計(jì)），使 Ca2+與SO42-結(jié)合后，邊加邊攪拌均勻，邊加邊攪拌，使溶液中最終仍含有0.1M CaCl2。
2．用5M NaOH調(diào)pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，于室溫下活化8～10小時(shí)，（2～3小時(shí)取樣一次，并用0.001M HCl稀釋），測(cè)定酶活性增加的情況。
3．活化完成（比活約3500～4000BAEE單位）后，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4沉淀。
（三）胰蛋白酶的分離
1．將已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細(xì)粉狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時(shí)后，抽濾，棄去濾餅。
2．濾液按250克/升加入研細(xì)的硫酸銨，使溶液飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時(shí)，抽濾，棄去濾液。
（四）胰蛋白酶的結(jié)晶
1．將上述胰蛋白酶濾餅（粗胰蛋白酶）溶解后進(jìn)行結(jié)晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計(jì)加入緩沖液，小心攪拌溶解。
2．用2M NaOH調(diào)pH至8.0，注意要小心調(diào)節(jié)，偏酸不易結(jié)晶，偏堿易失活，存放于冰箱。3．放置數(shù)小時(shí)后，應(yīng)出現(xiàn)大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態(tài)，再加入總體積的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態(tài)分散，必要時(shí)加入少許胰蛋白酶晶體。
4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，待結(jié)晶析出完全時(shí)，抽濾，母液回收。
（五）胰蛋白酶的重結(jié)晶
將第一次結(jié)晶的胰蛋白酶產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶：用約1倍的0.025M HCl，使上述結(jié)晶分散，加入約1.0～1.5倍體積的pH9.0
的0.8M硼酸緩沖液，至結(jié)晶酶全部溶解，取樣后，用2M
NaOH調(diào)溶液pH至8.0（準(zhǔn)確）（體積過大，很難結(jié)晶），冰箱放置1～2天，可將大量結(jié)晶抽濾得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(母液回收)，冰凍干燥后得重結(jié)晶的豬胰蛋白酶。
二、胰蛋白酶活性的測(cè)定
以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文縮寫為BAEE）為底物，用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波長
253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于苯甲酰L—精氨酸（英文縮寫為BA）。在胰蛋白酶的催化下，隨著酯鍵的水解，苯甲酰L—精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加。
取2個(gè)光程為1厘米的帶蓋石英比色杯，分別加入25℃予熱過的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L
HCl，作為空白，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另一比色杯中加入0.2ml待測(cè)酶液（用量一般為10微克結(jié)晶的胰蛋白酶），立即混勻并記時(shí)，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀3~4分鐘?？刂艱A253/min
在0.05 ~ 0.100左右為宜。
繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，從曲線上求出反應(yīng)起始點(diǎn)吸光度隨時(shí)間的變化率（即初速度）DA253/min。
胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25℃，反應(yīng)體積3.0ml，光徑1厘米的條件下，測(cè)定DA253，每分鐘使DA253增加0.001，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位。
胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/ mL）＝
胰蛋白酶比活力（BAEE單位 / mg ）＝
注意事項(xiàng)
（1）胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
（2）在室溫14～20℃條件下8～12小時(shí)可激活完全，激活時(shí)間過長，因酶本身自溶而會(huì)使比活降低，比活性達(dá)到 “3000～4000BAEE單位/mg蛋白”時(shí)即可停止激活。
（3）要想獲得胰蛋白酶結(jié)晶，在進(jìn)行結(jié)晶時(shí)應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養(yǎng)結(jié)晶也較容易，因此每一步操作都要嚴(yán)格。酶蛋白溶液過稀難形成結(jié)晶，過濃則易形成無定形沉淀析出，因此，必需恰到好處，一般來說待結(jié)晶的溶液開始時(shí)應(yīng)略呈微渾濁狀態(tài)。
（4）過酸或過堿都會(huì)影響結(jié)晶的形成及酶活力變化，必須嚴(yán)格控制PH。
（5）第一次結(jié)晶時(shí)，3～5天后仍然無結(jié)晶，應(yīng)檢查pH，必要時(shí)調(diào)整pH或接種，促使結(jié)晶形成。重結(jié)晶時(shí)間要短些。
