小鼠脾臟T細(xì)胞和人PBMCs的體外T細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)（一）
導(dǎo)言
成熟T細(xì)胞通過TCR識別并與抗原-MHC復(fù)合物反應(yīng)。TCR活化的最直接后果是信號通路的起始，這些信號通路包括誘導(dǎo)特異性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2分解、PKC活化以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。這些早期事件被傳遞到核，產(chǎn)生諸多效應(yīng)：
1、 T細(xì)胞克隆的擴(kuò)增
2、 細(xì)胞表面活化標(biāo)志的上調(diào)
3、 分化成效應(yīng)性細(xì)胞
4、 誘導(dǎo)細(xì)胞毒或細(xì)胞因子的分泌
5、 誘導(dǎo)凋亡
最常用的體外刺激檢測 T細(xì)胞增殖的方法是用 TCR的抗原或競爭性抗體活化 T細(xì)胞。
本 protocol 是一個(gè)基本方法，用 CD3 體外刺激小鼠脾 T 細(xì)胞和人類外周血 T細(xì)胞的增殖，關(guān)鍵參數(shù)包括細(xì)胞密度、抗體滴度和活化動(dòng)力學(xué)。
一、 小鼠：
用包被的 145-2C11單抗刺激小鼠T細(xì)胞；MTT法測細(xì)胞增殖
材料
1X 無菌 PBS
Anti-mouse CD3e, Clone 145-2C11 (Functional Grade, eBioscience Cat. No. 16-0031, or Purified,eBioscience Cat. No. 14-0031)
RPMI-1640 完全培養(yǎng)基
無菌的小鼠脾臟或淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液
96 孔平底帶蓋微孔板
MTT Buffer
MTT裂解液
刀豆蛋白 A，可選 (ConA, Sigma Cat. No. C5275)
儀器用具
微量移液器或排槍
離心機(jī)
37°C, CO2培養(yǎng)箱
96孔板讀板機(jī)
實(shí)驗(yàn)時(shí)間
2小時(shí)包被抗體
20分鐘制備脾臟單細(xì)胞懸液
20分鐘分析設(shè)置
2-4天孵育
實(shí)驗(yàn)步驟
抗體包被至微孔板：
1、 用無菌 PBS 制備 5-10μg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗體溶液，計(jì)算所需的抗體量，每個(gè)條件或樣品做復(fù)孔。例如，包被半張板需要 2.6ml 抗體溶液。若用其他抗體共刺激時(shí)，CD3 抗體的濃度可以降低。
2、 每孔加入 50μl 抗體，空白對照孔加 50μl 無菌 PBS。
3、 用ParafilmTM膜將板封好，37℃孵育 2 小時(shí)或 4℃過夜。
4、 加細(xì)胞之前，將孔內(nèi)的抗體溶液吸去。
5、 每孔用 200μl 無菌 PBS 洗后，棄去 PBS。
6、 重復(fù)洗一次，去除所有的未結(jié)合抗體。
加細(xì)胞：
1、 取脾臟，無菌制備單細(xì)胞懸液。溶血去除紅細(xì)胞。
2、 計(jì)數(shù)細(xì)胞并重懸于RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，濃度為 106/ml。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可選擇 2-3x106/ml～105/ml的濃度。
3、 洗板結(jié)束后，每孔加 200μl 細(xì)胞懸液，置于潮濕的 37°C, 5% CO2 培養(yǎng)箱中。可選擇加刺激對照：ConA 1-4μg/ml 刺激后孵育。
4、 孵育 2-4 天?？筛鶕?jù)具體的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。
5、 每孔加 20μl MTT buffer 再放回至培養(yǎng)箱中孵育 4 小時(shí)。
6、 每孔加 50μl MTT 裂解液，輕輕振蕩并孵育過夜。
7、 第二天 570nm 讀板。
8、 計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差，作圖。
二、 人：
用 CD3 單抗刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）；MTT 法檢測細(xì)胞增殖。
