|
一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 用于質(zhì)粒篩選的抗生素
(2) 氯霉素（34 mg/ml )
(3) 氯仿
(4) EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0 )
(5) 乙醇
(6) NaCl ( 5 mol/L)
(7) 酚：氯仿（1:1，V/V )
(8) SDS ( 10%，m/V )
(9) STE，冰預(yù)冷
(10) TE ( pH 8.0)
(11) Tris-蔗糖
2. 酶和緩沖液
(1) 溶菌酶（10 mg/ml )
(2) 限制性內(nèi)切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠
4. 培養(yǎng)基
LB、YT 或 Terrific 培養(yǎng)液
5. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)頭
(1) Beckman type-50 超速離心機(jī)或與其相當(dāng)?shù)碾x心機(jī)，Oak Ridge (橡樹(shù)脊）塑料離心管（30 ml 帶螺口蓋，Nalgene 產(chǎn)）
(2) Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭
6. 專用設(shè)備
硬質(zhì)玻棒
二、方法
1. 細(xì)胞的準(zhǔn)備
(1) 在含適當(dāng)抗生素的 30 ml 培養(yǎng)基（LB、YT 或 Terrific 培養(yǎng)液）中接種單一的轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落或 0.1~1.0 ml 培養(yǎng)自單一轉(zhuǎn)化子的對(duì)數(shù)晚期菌液。
(2) 劇烈振搖培養(yǎng)至細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期（即 OD600 為 0.6 ) 。
為了確保培養(yǎng)物通氣良好：試管的體積應(yīng)該至少比細(xì)菌培養(yǎng)物的體積大 4 倍；試管不宜蓋緊；培養(yǎng)物應(yīng)在劇烈振搖下培養(yǎng)。
(3) 在 2 L 三角燒瓶中含適當(dāng)抗生素的 500 ml LB、YT 或肉湯（預(yù)熱至 37℃，2L 培養(yǎng)瓶）中接種 25 ml 對(duì)數(shù)晚期菌液。37℃，劇烈振搖約 2.5 h ( 250 r/min）。
最終培養(yǎng)液 OD600 應(yīng)為約 0.4。由于含不同質(zhì)粒的不同菌株或同一苗株的生長(zhǎng)速度不盡相同，因此有時(shí)達(dá)到合適密度的培養(yǎng)時(shí)間可能稍長(zhǎng)或稍短于 2.5 h。
(4) 對(duì)于拷貝數(shù)低或中等的松弛型質(zhì)粒，加入 2.5 ml 濃度為 34 mg/ml 氯霉素。培養(yǎng)液中氯霉素終濃度應(yīng)為 170 μg/ml。
重要：對(duì)于高拷貝質(zhì)粒，不必添加氯霉素。
(5) 37℃，劇烈振搖，12~16 h ( 250 r/min )。
(6) 從培養(yǎng)液中取 1~2 ml 于干凈離心管中，4℃ 保存。其余于 4℃ 2700 g ( 對(duì)于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭為 4100 r/min）離心 15 min 收集細(xì)菌。棄上清。將離心瓶倒置，使所有上清流盡。
(7) 細(xì)菌沉淀用 200 ml 冰預(yù)冷的 STE 重懸。按步驟 6 離心，在離心瓶中保存細(xì)菌沉淀于 -20℃。
(8) 從步驟 6 保存的 1~2 ml 菌液中提取質(zhì)粒 DNA。用適當(dāng)?shù)南拗泼赶铜傊请娪敬_定大量培養(yǎng)物中的質(zhì)粒得到正確擴(kuò)增。
這一步似乎顯得多余，但提供了有價(jià)值的確證，從而防止產(chǎn)生難以挽回的錯(cuò)誤和浪費(fèi)大量的時(shí)間。
2. 細(xì)胞的裂解
(1) 將步驟 7 的凍存細(xì)菌沉淀置室溫 5~10 min 融化，用 10 ml 冰預(yù)冷的 Tris-蔗糖溶液重懸，將懸液移入 30 ml 塑料螺口管中。
(2) 依次加入 2 ml 新鮮的溶菌酶溶液 ( 10 mg/ml ) 和 8 ml 0.25 mol/L EDTA ( pH 8.0 )。
(3) 溫和顛倒管子數(shù)次以混勻懸液，冰上放置 10 min。
溶酶菌和 EDTA 聯(lián)用可破裂細(xì)菌胞壁，并使外膜穿孔，所得原生質(zhì)球盡管可滲漏，但在等滲的蔗糖溶液中是穩(wěn)定的。
(4) 加 4 ml 10%SDS，立即用玻棒混勻，使 SDS 在細(xì)菌懸液中均勻分布。為減少釋出的染色體 DNA 斷裂，操作應(yīng)盡可能溫和。
(5) 一旦混勻，立即加入 6 ml 5 mol/L NaCl ( 終濃度 1 mol/L），再用玻棒溫和徹底地混勻。置冰上至少 1 h。
3. 質(zhì)粒 DNA 的回收
(1) 于 4℃ 離心 30 min，7100 g ( Beckman Type 50 轉(zhuǎn)頭為 30000 r/min)，以去除高分子質(zhì)量 DNA 和細(xì)菌碎片。小心將上清移入 50 ml 一次性塑料離心管，棄沉淀。
如果細(xì)菌沉淀不密實(shí)，則重新離心 20 min，96000 g（Beckman Type 50 轉(zhuǎn)頭，35000 r/min），并將上淸盡可能多地轉(zhuǎn)移至干凈管中。棄去離心管中余下的黏稠液體。
(2) 上清用酚：氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。
(3) 將水相轉(zhuǎn)移到 250 ml 離心瓶，加 2 倍體積（約 60 ml ) 乙醇，混勻，室溫放置 1~2 h。
(4) 收獲質(zhì)粒：4℃ 離心 20 min，5000 g ( Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭為 5500 r/min 或 Sorvall HS4 水平轉(zhuǎn)頭為 5100 r/min)。
對(duì)于此步，水平轉(zhuǎn)頭比角轉(zhuǎn)頭好，這是因?yàn)槠淇蓪①|(zhì)粒聚集于瓶底而不是布滿管壁。
(5) 棄上清，室溫下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁，然后按步驟 4 離心。
(6) 盡可能將乙醇倒盡，將離心瓶倒置于一疊紙巾上，使乙醇流干。用真空抽吸器抽干離心瓶壁上的乙醇小滴。倒置離心瓶直至無(wú)乙醇?xì)埩?。這時(shí)沉淀應(yīng)保持濕潤(rùn)。
(7) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解濕潤(rùn)的質(zhì)粒沉淀。
(8) 用商品化樹(shù)脂或用 CsCl-溴化乙錠等密度梯度離心進(jìn)一步純化粗制的質(zhì)粒 DNA。
大質(zhì)粒（>15 kb ) 容易在純化質(zhì)粒的多次聚乙二醇沉淀中產(chǎn)生缺口。
(9) 依次用限制酶消化和凝膠電泳鑒定質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
? ? ? ? ? ? 展開(kāi)?
? ? ? ? ? | 
