藥物檢測案例--水楊酸類藥物及其制劑的質(zhì)量檢測
氟尼藥典收載的水楊酸類藥物有水楊酸、水楊酸二乙胺、水楊酸鎂、阿司四林、對氨基水楊酸鈉、貝諾酯、二氟尼柳和雙水楊酯等。?
一、性狀
?阿司匹林、對氨基水楊酸鈉、貝諾酯和二氟尼柳的性狀描述見表1。
二、鑒別
?(一)化學(xué)法
1.三氯化鐵反應(yīng)此反應(yīng)為酚羥基的反應(yīng),結(jié)構(gòu)中含有酚羥基的藥物可利用本反應(yīng)進(jìn)行鑒別。
水楊酸類藥物在中性或弱酸性條件下,與三氯化鐵試液反應(yīng),生成紫色配合物。
此反應(yīng)適宜的pH為4～6,在強(qiáng)酸性溶液中配位化合物分解。本反應(yīng)極為靈敏,只需要取稀溶液進(jìn)行試驗(yàn);若取樣量大產(chǎn)生顏色過深時(shí),可加水稀釋后觀察。
對氨基水楊酸鈉加稀鹽酸呈酸性后,可與鐵離子形成紫紅色的配位化合物。貝諾酯需加氫氧化鈉試液煮沸,使酯水解,濾過,液加鹽酸適量至顯微酸性,然后加三氯化鐵試液,可顯紫色。阿司匹林需加熱水解生成水楊酸后才顯紫色,方法為:取本品約0.1g,加水10ml,煮沸放冷后,加三氯化鐵試液1滴,即顯紫堇色。
阿司匹林片和貝諾酯片可取細(xì)粉按原料藥方法直接鑒別。阿司匹林栓劑則需提取阿司匹林后再按原料藥方法鑒別,方法為:取本品適量(約相當(dāng)于阿司匹林0.6g)加乙醇20ml,微溫使阿司匹林溶解,置冰浴中冷卻5分鐘并不斷攪拌,濾過濾液置水浴上蒸干,殘?jiān)赵系姆椒ㄨb別。
2.水解產(chǎn)物反應(yīng)阿司匹林具有酯鍵,在堿性條件下水解后,生成水楊酸鈉和醋酸鈉。水楊酸鈉與游離水楊酸在水中溶解度明顯不同,可利用其溶解度差異觀察溶解與沉淀的現(xiàn)象;因醋酸有揮發(fā)性,酸化時(shí)可聞到醋酸臭味。方法為:取阿司匹林0.5g,加碳酸鈉試液10ml,煮沸2分鐘后,放冷,加過量的稀硫酸,即析出白色沉淀,并發(fā)生醋酸的臭氣。
若為阿司匹林片劑,加熱放冷后,應(yīng)濾除片劑輔料等,再在濾液中進(jìn)行酸化,否擾反應(yīng)結(jié)果的觀察。
3.芳香第一胺類的鑒別反應(yīng) ? 此反應(yīng)為芳伯氨基或潛在芳伯氨基的反應(yīng),通常也稱為重氮化-偶合反應(yīng),即在酸性溶液中,具有此結(jié)構(gòu)特征的藥物與亞硝酸試液發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽,再與堿性B-萘酚試液偶合生成橙紅色沉淀。例如,對氨基水楊酸鈉具有芳伯氨基,而貝諾酯加酸發(fā)生水解反應(yīng)后產(chǎn)生芳伯氨基,可用此反應(yīng)進(jìn)行鑒別貝諾酯的鑒別方法:取貝諾酯約0.1g,加稀鹽酸5ml煮沸,放冷,濾過,濾液加0.1mol/L亞硝酸鈉溶液數(shù)滴,滴加堿性B-萘酚試液數(shù)滴,生成橙紅色沉淀。
貝諾酯片可取片粉按原料藥方法直接鑒別。
(二)光譜法
?1.紫外-可見分光光度法具有共軛雙鍵、苯環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物,在紫外可見光區(qū)有特征吸收,可用于定性鑒別。藥典采用紫外-可見分光光度法鑒別貝諾酯、二氟尼柳等。
(1)貝諾酯鑒別方法:取本品適量,精密稱定,無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含7.5μg的溶液,照紫外一可見分光光度法測定,在240nm的波長處有最大吸收;在240nm的波長處測定吸光度,按干燥品計(jì)算,吸收系數(shù)(
)為730～760。
(2)二氟尼柳鑒別方法:取本品,加0.1mol/L鹽酸乙醇溶液溶解并稀釋制成1ml中含有20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在251nm與的315nm的波長處有最大吸收,吸光度比值應(yīng)為4.2～4.6。
2.紅外分光光度法 ? 紅外分光光度法具有特征性強(qiáng)、專屬性好的特點(diǎn),絕大多數(shù)藥物的原料藥均用紅外分光光度法鑒別,制劑由于輔料的干擾,一般不采用。藥典采用紅外分光光度法鑒別水楊酸、水楊酸鎂、阿司匹林、對氨基水楊酸鈉、貝諾酯、二氟尼柳等原料藥,要求供試品的紅外吸收光譜應(yīng)與對照圖譜一致。
(三)色譜法
?1.高效液相色譜法藥典采用高效液相色譜法鑒別阿司匹林片、腸溶片、腸溶膠囊、泡騰片,貝諾酯片及對氨基水楊酸鈉腸溶片,注射用對氨基水楊酸鈉等,要求在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。
2.薄層色譜法藥典采用薄層色譜法鑒別二氟尼柳膠囊。方法為:取內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于二氟尼柳50mg),加甲醇5ml,振搖使二氟尼柳溶解,濾過,濾液做為供試品溶液;另稱取二氟尼柳對照品適量,用甲醇制成每1ml約含10mg的溶液,作為對照品溶液,照薄層色譜法試驗(yàn),吸取上述兩液各5μl,分別點(diǎn)于同一硅膠GF24薄層板上,以正己烷-二氧六環(huán)-冰醋酸(85:10:5)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外線燈(25nm)下檢視,供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的位置和顏色應(yīng)與對照品溶液的主斑點(diǎn)相同。
三、檢查
?(一)特殊雜質(zhì)檢查
?1.阿司匹林及其制劑中特殊雜質(zhì)檢查
?(1)游離水楊酸:由于阿司匹林在合成過程中水楊酸的乙?；磻?yīng)不完全或在貯藏過程中水解而產(chǎn)生水楊酸,水楊酸對人體有一定毒性,且其分子中含有酚羥基,在空氣中易被氧化生成有色醌類化合物,如淡黃色、紅棕色甚至棕色,從而使阿司匹林變色,故需加以控制。藥典采用HPLC法檢查阿司四林及其制劑中的游離水楊酸。
阿司匹林中游離水楊酸的檢查方法:取本品約g,密稱定,置10ml量瓶中加冰酸甲醇溶液適量,振搖使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(臨雨新制取水楊酸對照品約10mg,精密稱定,置100ml量瓶中,加1%冰醋酸甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml,置50ml量瓶中用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液;照高效液相色譜法試驗(yàn)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈—四氫呋喃—冰醋酸—水(20:5:5:70)為流動(dòng)相:檢測波長為303nm理論板數(shù)按水楊酸峰計(jì)算不低于5000,阿司匹林峰與水楊酸峰的分離度應(yīng)符合要求。立即精密量取供試品溶液、對照品溶液各10μl,別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,供試品溶液色譜圖中如有與水楊酸峰保留時(shí)間一致的色譜峰,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,不得過0.1%。水楊酸的雜質(zhì)限量按式計(jì)算
式中,As為供試品溶液的峰面積;Ar為對照品溶液的峰面積;Ds為供試品溶液的稀釋倍數(shù);Dr為對照品溶液的稀釋倍數(shù);Vs為供試品溶液的定容體積;Vr為對照品溶液的定容體積;ms為供試品的稱樣量;mr為對照品的稱樣量。
由于阿司匹林在制劑過程中易水解生成水楊酸,因此藥典規(guī)定阿司匹林片腸溶片、腸溶膠囊、泡騰片及栓劑均照原料藥方法與色譜條件檢查水楊酸。
(2)有關(guān)物質(zhì):阿司匹林中有關(guān)物質(zhì)系指除水楊酸以外的合成中引入的其他原料及副產(chǎn)物,如醋酸苯酯、水楊酸苯酯、乙酰水楊酸苯酯等。藥典采用高效液相色譜法的面積歸一化法檢查,以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-四氫呋哺-冰醋酸-水(20:5:5:70)為流動(dòng)相A、乙腈為流動(dòng)相B,梯度洗脫;檢測波長為276nm;以供試品溶液(10mg/ml)的稀釋液(0.5%)為對照溶液。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,除水楊酸外,其他雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積。
2.貝諾酯中特殊雜質(zhì)的檢查
?(1)游離水楊酸:藥典采用目視比色法檢查貝諾酯中的游離水楊酸。檢查的原理為利用貝諾酯結(jié)構(gòu)中無酚羥基,不能與高鐵鹽作用,而水楊酸則可與高鐵鹽反應(yīng)呈紫色,與一定量水楊酸對照溶液生成的色澤比較,從而控制游離水楊酸的限量。方法為:取本品0.1g,加乙醇5ml,加熱溶解后,加水適量,搖勻,濾入50ml比色管中,加水使成50ml,立即加新制的稀硫酸鐵銨溶液1ml,搖勻,30鐘內(nèi)如顯色,與對照液(精密稱取水楊酸0.1g,置1000ml量瓶中,加水溶解后,加冰醋酸1ml,搖勻,再加水適量至刻度,搖勻,精密量取1ml,加乙醇5ml與水44ml,再加上述新制的稀硫酸鐵銨溶液1ml,搖勻)比較,不得更深(0.1%)。
(2)對氨基酚:藥典采用靈敏度法檢查貝諾酯中的對氨基酚。其原理是利用對氨基酚堿性條件下能與亞硝基鐵氰化鈉生成藍(lán)色配位化合物,而貝諾酯無此反應(yīng)。
取本品1.0g,加甲醇溶液(1→2)20ml,攪勻,加堿性亞硝基鐵氰化鈉試液1ml,搖勻,放置30分鐘,不得顯藍(lán)綠色。
(3)有關(guān)物質(zhì):貝諾酯中含有對乙氨基酚、乙撲熱息痛、阿司匹林、水楊酸等多種質(zhì)。藥典采用HPLC法的自身稀釋對照法和雜質(zhì)對照品法控制其限量。以十八烷烷鍵合硅膠為填充劑;以水(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.5)-甲醇(44:56)為流動(dòng)相;檢測波長為240nm。以供試品溶液(0.4mg/ml)的稀釋液(1%)為對照液,以10μg/ml的對乙酰氨基酚為對照品溶液,規(guī)定供試品溶液的色諧圖中如有與對照品溶液主峰保留時(shí)間一致的色譜峰,其峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.1倍;其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積均不得大對照溶液主峰面積的0.5倍;各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積。
3.對氨基水楊酸鈉中有關(guān)物質(zhì)的檢查?
?對氨基水楊酸鈉一般以間氮基酚為原料進(jìn)行合成,致使對氨基水楊酸鈉中可能引入間氨基酚及反應(yīng)副產(chǎn)物。間氨基酚不僅有,而且易被氧化變色,故藥典采用HPLC法控制有關(guān)物質(zhì)的限量。
(二)制劑檢查
?貝諾酯片溶出度的測定貝諾酯不溶于水,體內(nèi)吸收受到溶解速度的影響,因要測定其溶出度。藥典采用紫外-可見分光光度法測定貝諾酯片的溶出度。
測定方法:取本品,照溶出度測定法(第二法),以1%十二烷基硫酸鈉溶液1000mL為溶出介質(zhì),轉(zhuǎn)速為每分鐘90轉(zhuǎn),依法操作、經(jīng)45分鐘時(shí),取溶液10m,濾過,精密量取續(xù)濾液適量;用水稀釋制成每1ml中含有貝諾酯8g的溶液,作為供試品溶液;另取貝諾對照品20mg,精密稱定,置50ml量瓶中,加無水乙醇溶解并稀釋至刻度,播勻,精密量取2ml至100ml量瓶中,用溶出介質(zhì)稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。取上述兩種溶液,照紫外一可見分光光度法,在240mm的波長處分別測定吸光度,計(jì)算每片的溶出量。限度為標(biāo)示量的65%,應(yīng)符合規(guī)定。每片的溶出量按式計(jì)算
?式中,As為供試品溶液的吸光度;Ar為對照品溶液的吸光度;Ds為供試品溶液的稀釋倍數(shù);Dr為對照品溶液的稀釋倍數(shù)100/2=50;V介質(zhì)為溶出介質(zhì)的體積1000ml;Vr為對照品溶液的定容體積50ml;mr為對照品的稱樣量。
2.釋放度的測定?? 釋放度系指口服藥物從緩釋制劑、控釋制劑,腸溶制劑及透皮劑等在規(guī)定溶劑中釋放的速度和程度。阿司匹林腸溶片、腸溶膠囊需進(jìn)行釋放度的測定。
例如,藥典中阿司匹林腸溶片的釋放度測定方法如下。
酸中釋放量取本品,照釋放度測定法,采用溶出度測定法第一法裝置,以0.1mol酸溶液600ml(25mg規(guī)格)為溶出介質(zhì),轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn),依法操作,經(jīng)2小時(shí)后取溶液10ml,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液;取阿司匹林對照品,精密稱定,加1%冰酸甲醇溶液溶解并稀釋制成4.25μgml(25mg規(guī)格)的溶液,作為對照品溶液。照含量定項(xiàng)下方法測定。計(jì)算每片中阿司匹林的釋放量,限度應(yīng)小于阿司匹林標(biāo)示量的10%緩沖溶液中釋放量在酸中釋放量檢查項(xiàng)下的溶液中繼續(xù)加入37℃的0.2 mol/l溶液2u5mg規(guī)格),混勻,用2mol/L鹽酸溶液或2mL氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為6.8±0.05,繼續(xù)溶出45分鐘,取溶液10ml,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
另取阿司匹林對照品適量,精密稱定,用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并稀釋制成22μg/ml(25mg規(guī)格)的溶液,作為阿司匹林對照品溶液;另取水楊酸對照品,精密稱定,用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并稀釋制成1.7μg/ml(25mg規(guī)格)的溶液,作為水楊酸對照品溶液。照含量測定項(xiàng)下色譜條件,精密量取供試品溶液、阿司匹林對照品溶液與水楊酸對照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算出每片中阿司匹林和水楊酸的含量,將水楊酸含量乘以1.034后,與阿司匹林含量相加即得每片緩沖溶液中的釋放量。限度為標(biāo)示量的70%。
?四、含量測定
(一)酸堿滴定法
阿司匹林結(jié)構(gòu)中游離羧基的酸性,其電離常數(shù)為3.27×10-4,可采用標(biāo)準(zhǔn)堿滴定液直接滴定。
測定方法:取本品約0.4g,精密稱定,加中性乙醇(對酚酞指示液顯中性)20ml溶解后,加酚酞指示液3滴,用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/)滴定。每1ml氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于18.02mg的C9H8O4。按干燥品計(jì)算,含C9H8O4不得少于99.5%。
阿司匹林具有酯的結(jié)構(gòu),為了使阿司匹林易于溶解并防止其酯鍵在滴定時(shí)水解而致使測定結(jié)果偏高,故不用水為溶劑,而選用中性乙醇溶液溶解供試品。本品屬于弱酸,用強(qiáng)堿滴定時(shí),化學(xué)計(jì)量點(diǎn)偏堿性,故指示劑選用在堿性區(qū)變色的酚酞。滴定時(shí)應(yīng)在不斷振搖下稍快地進(jìn)行,以防止局部堿度過大而促使其水解。試驗(yàn)表明當(dāng)溫度在0～40℃時(shí),對測定結(jié)果幾乎沒有影響。供試品中所含水楊酸超過規(guī)定限度時(shí),不宜用直接滴定法測定。
(二)紫外-可見分光光度法
?本類藥物的結(jié)構(gòu)中有共軛系統(tǒng),具有紫外吸收,可采用紫外-可見分光光度法測定其含量。
(三)高效液相色譜法
?為了分離原料藥的制劑中的雜質(zhì)、輔料及穩(wěn)定劑等,藥典采用高效液相色譜中的外標(biāo)法測定阿司匹林各種制劑、對氨基水楊酸鈉及其制劑、貝諾酯及其片劑的含量。
例如,阿司匹林片的含量測定方法為:取本品20片,精密稱定,充分研細(xì),精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于阿司四林10mg),置100ml量瓶中,用1%冰醋酸甲醇溶液強(qiáng)烈振搖使阿司匹林溶解,并用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻?yàn)V膜濾過,精密量取續(xù)濾液10μ注入液相色譜儀,記錄色譜圖。另取阿司匹林對照品,精密測定,加1%冰醋酸溶液振搖使溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.g的溶液,同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,即得。阿司匹林片標(biāo)示量的百分含量按式阿司匹林片標(biāo)示量%=計(jì)算:
式中,Cr為對照品溶液的濃度;Ar為對照品峰面積;AS為供試品峰面積;D為稀釋倍數(shù),1;V為定容體積,100ml;ms為供試品的取樣量(g)。
五、其他水楊酸類藥物的質(zhì)量檢測
?除上述介紹的藥物外,《中國藥典》二部還收載了其他水楊酸類藥物,其檢測項(xiàng)目與方法各異。
