新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識
今日，國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）宣布，新型冠狀病毒（2019-nCoV）的正式分類名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。而世界衛(wèi)生組織（WHO）同日宣布，由這一病毒導(dǎo)致的疾病的正式名稱為COVID-19。
突發(fā)新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）肺炎疫情以來，感染病例快速上升。隨著疫情的發(fā)展和防控力度加大，全國各地乃至境外均有病例報道，及時對急重癥及疑似患者進行診斷需要快速有效的方法，病毒核酸檢測可為診斷提供直接證據(jù)。核酸檢測過程中因?qū)Σ≡w的傳染途徑和致病力尚未完全明確，工作人員在核酸檢測過程中存在較大的感染風險。此外，因為2019-nCoV基因結(jié)構(gòu)與一般RNA差別較大，因此檢驗流程、檢驗質(zhì)量和生物安全均需要有一定的指導(dǎo)。本共識在參閱國家衛(wèi)生健康委員會相關(guān)文件、查閱文獻、咨詢重疫區(qū)相關(guān)專家的基礎(chǔ)上進行編寫，以對實驗室檢測工作提出有指導(dǎo)性的建議，本共識適用于從事2019-nCoV核酸檢測的所有實驗室。
適用范圍
適用于2019-nCoV核酸檢測，如采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法檢測等。
工作程序
一、標本采集
（一）標本采集人員
采集人員必須經(jīng)過院感管理部門或上級管理部門舉辦的生物安全培訓，并考核合格。標本采集人員應(yīng)按三級防護配備防護用品，包括工作服、防護服、一次性工作帽、醫(yī)用防護口罩（N95）、外科口罩、護目鏡、面罩、雙層手套、防水靴和鞋套。配備防止病原微生物擴散和感染的設(shè)施，如處理感染性廢棄物的垃圾桶、處理緊急意外事件的藥具和具備一定的通風條件等。
（二）受檢人群
新型冠狀病毒肺炎疑似病例、確診病例或與上述二者有密切接觸史者。
（三）標本采集及包裝
輕癥患者、高度疑似患者或有密切接觸史者，標本采集優(yōu)選順序為鼻咽拭子、口咽拭子、痰液，為提高陽性率，可同時采集1份鼻咽拭子和1份口咽拭子于同一標本采集管中；為觀察療效和控制傳染源，可對確診患者的糞便和血液進行檢測。
1．鼻咽拭子：
標本采集管先貼好條形碼，盡可能采集患者發(fā)病3 d內(nèi)的鼻咽拭子標本。以拭子測量鼻尖到耳垂的距離并用手指做標記，將拭子以垂直鼻子（面部）方向插入鼻腔，拭子深入距離最少應(yīng)達耳垂部位到鼻尖長度的一半，使拭子在鼻內(nèi)停留15~30 s，輕輕旋轉(zhuǎn)3~5次，迅速將拭子放入裝有2 ml裂解液（與核酸提取試劑盒中裂解液相同）的標本采集管或含RNA酶抑制劑的細胞保存液中，插入拭子后在靠近頂端處折斷無菌拭子桿，旋緊管蓋并用封口膜封閉。
2．口咽拭子：
標本采集管先貼好條形碼。盡可能采集發(fā)病3 d內(nèi)患者的咽拭子標本。宜用無菌植絨拭子采樣，適度用力拭抹咽后壁部位，應(yīng)避免觸及舌部；迅速將無菌拭子放入用于采集鼻咽拭子的采集管中，在靠近頂端處折斷無菌拭子桿，旋緊管蓋并用封口膜封閉。
3．痰液：
標本采集管先貼好條形碼。收集痰液標本時不宜開放氣道收集標本。收集深部咳嗽痰液于一次性無菌旋蓋采樣杯中，采樣杯中裝入2 ml蛋白酶K（1g/L)。收集痰液后旋緊杯蓋并用封口膜封口，盡可能30 min內(nèi)送檢。如果需長距離運輸標本時不宜先添加蛋白酶K。
4．肺泡灌洗液（BALF）：
重癥患者或病情進展迅速的肺炎患者，由臨床醫(yī)生無菌操作下吸取≥5 ml BALF到貼有標本條形碼并帶螺帽的50 ml無菌容器中。收集標本后旋緊標本蓋并用封口膜封口。
5．血液：
發(fā)病后7 d內(nèi)或危重癥患者，或考慮病毒血癥患者，可采集血液標本。標本采集管先貼好條形碼。使用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的真空釆血管采集血液標本2~4 ml。
6．糞便：
如發(fā)病早期出現(xiàn)腹瀉等消化道癥狀的患者，則留取糞便標本3~5 g(黃豆大小)。標本采集管先貼好條形碼。標本收集于含2 ml生理鹽水（有條件時可添加RNA酶抑制劑）的帶螺帽標本采集管中并用封口膜封口。
7．標本包裝：
采集標本后用75%乙醇噴灑標本采集管外部，立即放入標有“生物危險”密封袋中并封嚴封口；再用75%乙醇噴灑密封袋外部，然后放入標本轉(zhuǎn)運容器，并對轉(zhuǎn)運容器進行外部消毒，及時送檢。
二、標本運輸
標本應(yīng)送至具備檢測資質(zhì)并經(jīng)省級衛(wèi)生行政主管部門批準可從事2019-nCoV核酸檢測的PCR實驗室。
1．送檢時間和溫度控制：
標本采集后應(yīng)盡快送檢，采集后應(yīng)盡可能在2～4 h內(nèi)送到實驗室。在2 ～8 ℃下轉(zhuǎn)運，運送時間應(yīng)不超過72 h。如超過72 h，應(yīng)-70 ℃或更低的溫度下保存和轉(zhuǎn)運。血液標本應(yīng)分離血漿后進行保存和轉(zhuǎn)運。
2．運輸容器：
標本運輸容器應(yīng)當防水、防破損、防泄露、耐高（低）溫和高壓。運輸容器和包裝材料上應(yīng)有相關(guān)規(guī)定的生物危害標識、警示語和提示語。運輸容器應(yīng)使用三層包裝系統(tǒng)，即內(nèi)層容器、中層包裝和外層包裝。防漏的內(nèi)層容器包裝后貼上生物危害標識，裝入中層容器，將“感染性物品”標記貼在外層包裝上。內(nèi)層容器和中層容器間應(yīng)放置足量的吸水性材料，中層容器應(yīng)固定在硬質(zhì)外層容器中。中層容器與外層容器間應(yīng)放置凝膠冰袋。
3．院內(nèi)運輸：
標本運送人員進行二級防護并隨身攜帶75%乙醇，以便發(fā)生意外時能及時處理，標本運送時宜派兩人同行，條件允許時應(yīng)配備標本轉(zhuǎn)運監(jiān)控裝置。
4．長距離運輸：
若標本需要遠距離運輸，應(yīng)當按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》辦理《準運證書》。2019-nCoV標本運輸包裝屬于A類，對應(yīng)的聯(lián)合國編號為UN2814。轉(zhuǎn)運者安全防護按二級防護要求佩戴，并隨身攜帶75%乙醇。司機佩戴外科口罩或N95口罩，通過專用車輛運輸。如果經(jīng)航空運輸，包裝還應(yīng)符合國際民航組織文件Doc9284-AN/905《危險品航空安全運輸技術(shù)細則》的PI602分類包裝要求。至少由1名標本運送人員和司機同時轉(zhuǎn)運標本，宜配備標本轉(zhuǎn)運過程監(jiān)控設(shè)施。
三、標本接收
1．生物安全防護：
標本接收人員按二級防護佩戴防護設(shè)備。
2．標本簽收：
標本運送人員和接收人員對標本進行雙簽收。接收標本前應(yīng)檢查標本轉(zhuǎn)運容器外包裝有無破損，打開容器前用75%乙醇對標本轉(zhuǎn)運容器進行噴灑或擦拭消毒。將標本轉(zhuǎn)運容器放入生物安全柜，在安全柜中打開標本轉(zhuǎn)運容器并立即用75%乙醇噴灑或擦拭消毒，取出標本密封袋后，對密封袋用75%乙醇噴灑或擦拭消毒，并檢查是否密封好，立即將標本放入專用冰箱冷藏保存。
3．標本接收后保存：
標本接收后，若無法及時檢測，可于4 ℃條件下短期（不超過24 h）保存，若需長期保存，可將標本于-70℃或更低的溫度下保存。
四、試劑準備
1．試劑選擇參考意見：
至少含2019-nCoV基因的兩個位點（開放讀碼框1a/b、核殼蛋白N或E結(jié)構(gòu)蛋白），反應(yīng)體系大，加樣量大；檢測試劑最好能與核酸提取儀配套使用，此外可選用引物不同的試劑盒便于對結(jié)果復(fù)核。
2．安全防護：
建議按三級防護要求進行防護；當條件不允許且各工作區(qū)分工作業(yè)時，試劑配制人員至少應(yīng)按《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗工作導(dǎo)則》穿工作服，戴一次性醫(yī)用帽子和手套。
五、標本前處理
標本前處理及核酸提取操作的工作人員應(yīng)進行三級防護。標本前處理應(yīng)在具有外排功能的生物安全柜中操作。生物安全柜中應(yīng)配備兩個廢棄物桶，一只桶中裝0.55%~1%含氯消毒液，另一只桶中裝1 mol/L稀鹽酸。前一只廢棄物桶用于丟棄標本、實驗過程中產(chǎn)生的廢液及與標本接觸過的實驗耗材；后一只廢棄物桶用于裝接觸過核酸的耗材。廢棄物桶應(yīng)完整并醒目地標示廢棄物內(nèi)容。每次對標本進行操作后，用75%乙醇消毒后棄去外層手套，對內(nèi)層手套用75%乙醇消毒后更換新外層手套。取出標本后用75%乙醇對標本外部進行噴灑或擦拭消毒。
（一）標本前處理
1．口咽拭子和鼻咽拭子：
可直接用于核酸提取，當實驗室條件不夠時可增加病毒滅活步驟，增加病毒滅活步驟可能會降低核酸檢測的靈敏度。
2．血液：
1 500×g離心10 min,，離心后冰浴3~5 min，吸取血漿提取核酸。
3．肺泡灌洗液和糞便：
應(yīng)充分振蕩混勻后進行病毒滅活。
4．痰液：
先在55 ℃下孵育15 min后再進行病毒滅活。如果痰液標本采集杯中沒有預(yù)加蛋白酶K，則應(yīng)在病毒滅活后重復(fù)此步驟。
（二）病毒滅活
提前將水浴箱預(yù)熱至56 ℃，在生物安全柜內(nèi)用75%乙醇對裝有標本的密封袋進行噴灑消毒，用吸水紙擦拭后放入水浴鍋中的試管架上，標本蓋上擱置重物，防止標本采集管漂浮。每隔10 min將標本搖勻1次（動作輕柔），滅活時間45 min?？筛鶕?jù)提取試劑在標本裂解時所采用的溫度調(diào)整滅活溫度，但不能低于56 ℃；提高溫度后可適當縮減滅活時間。滅活條件的優(yōu)化最好有預(yù)實驗支持，保證標本能在有效溫度下有足夠時間滅活。
六、核酸提取和加樣
1．實驗前消毒：
用75%乙醇對生物安全柜的空間和臺面以及核酸提取儀進行消毒，并紫外線照射30 min。有條件時可在生物安全柜操作臺面鋪一層吸水性材料。
2．標本準備：
將滅活后的標本從水浴鍋中取出，在生物安全柜內(nèi)對密封袋進行消毒，打開密封袋后，即時用75%酒精消毒，取出標本，1 500×g離心5 min后冰浴3~5 min。在生物安全柜內(nèi)打開標本采集管，按核酸提取試劑說明書要求吸取一定量標本（動作輕柔）加入核酸提取試劑中。為保證人員安全和核酸提取純度和效率，建議采用基于磁珠吸附的自動化核酸提取方法。
3．標本處理后消毒：
采用75%乙醇對生物安全柜、工作臺面、移液器等用品進行消毒。
4．核酸擴增體系的準備：
核酸提取完成后，立即將提取物進行封蓋處理。在生物安全柜內(nèi)將提取核酸加至PCR擴增反應(yīng)體系中。
5．實驗室消毒：
用75%乙醇對核酸提取儀進行處理并紫外線照射30 min。應(yīng)在實驗室空氣中噴灑75%乙醇，10 min后開啟通風裝置通風10 min（注意防爆，密閉空間如果通風不夠，可適當延長通風時間），再開啟實驗室紫外燈照射30 min。紫外線照射后，工作人員可著一次性醫(yī)用帽子、手套、隔離服、鞋套進入實驗室，用1 mol/L的鹽酸處理工作臺面和地面，并開啟實驗室通風裝置通風1 h后用清水清潔臺面和地面，最后可用過氧化氫消毒儀進行終末消毒。
七、核酸擴增
1．安全防護：
建議按三級防護要求進行防護，當條件不允許且各工作區(qū)分工作業(yè)時，擴增區(qū)工作人員可按二級防護佩戴防護用品，即穿隔離衣，戴一次性醫(yī)用帽子、醫(yī)用防護口罩（N95）、面罩、鞋套和單層手套。按試劑說明進行操作。
2．核酸擴增：
將擴增體系放入擴增儀，核對擴增程序是否與試劑說明書相符，啟動擴增程序，待反應(yīng)開始后離開實驗室。
3．擴增產(chǎn)物處理：
擴增后產(chǎn)物置于含1 mol/L的稀鹽酸中，應(yīng)將產(chǎn)物全部浸泡至液體中，浸泡后將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移出實驗室。如果擴增后產(chǎn)物未在擴增區(qū)浸泡稀鹽酸，可將擴增產(chǎn)物用一次性醫(yī)療垃圾袋裝好扎緊，轉(zhuǎn)移至擴增產(chǎn)物廢物處理區(qū)。
4．實驗室消毒：
擴增完成后用75%乙醇對空氣進行消毒，10 min后開啟通風裝置通風10 min，同樣要注意通風的效果，防止密閉空氣中酒精引發(fā)爆炸的危險，再用紫外燈照射30 min。紫外線照射后，工作人員著工作服、一次性醫(yī)用口罩和帽子進入實驗室，用1 mol/L稀鹽酸擦拭臺面和地面，清潔后應(yīng)及時通風，通風時間不得少于1 h，再用清水清潔臺面和地面。
結(jié)果解釋
一、報告方式
建議報告為“檢出”、“未檢出”和“可疑”，對3種報告方式進行充分的結(jié)果解釋，并對下一步工作提出建議。
二、判讀條件
1．判讀為“檢出”的條件：
需滿足以下任一條：（1） ORF1ab和N基因同時陽性時，判定為陽性；（2）若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測結(jié)果陽性時，需重新提取原標本的核酸進行復(fù)查，復(fù)查后ORF1ab或N基因仍為陽性時，判定為陽性。
2．判讀為"可疑"結(jié)果的處理：
當出現(xiàn)以下兩種情況時為“可疑”：（1）2個位點的Ct值位于陽性Ct值和陰性Ct值之間或其中1個位點判讀為陽性，另1個位點的Ct值位于陽性Ct值和陰性Ct值之間（具體請參考試劑盒說明書）；（2）2個位點中的1個位點為陰性，另1個位點的Ct值位于陽性Ct值和陰性Ct值之間。對于“可疑”陽性結(jié)果，建議對標本重新進行一次核酸提取，并與該標本前一次提取的核酸同時擴增檢測，結(jié)合兩次檢驗，2個位點可判斷為“陽性”則可報告“檢出”，否則應(yīng)報告“可疑”。當報告為“可疑”時，實驗室應(yīng)考慮以下措施：（1）更換不同廠家的試劑盒重復(fù)實驗或采用敏感度更高的方法，如數(shù)字PCR方法進一步確定；（2）建議臨床重新采集標本或更換部位采集標本再次檢測。
3．判讀為“未檢出”結(jié)果的處理：
當兩個位點擴增結(jié)果無反應(yīng)，可報告“未檢出”，并對結(jié)果進行解釋，此情況可能是病毒載量低于檢出限，應(yīng)結(jié)合臨床分析。當臨床體征及其他檢查高度懷疑2019-nCoV感染時，建議重新采集標本或更換部位采集標本再次檢測。
質(zhì)量控制
1．人員培訓：
標本采集人員應(yīng)熟練掌握采集方法；實驗室工作人員應(yīng)準確掌握工作流程和操作。
2．標本采集：
標本采集管中如果加入了裂解液或蛋白酶K，應(yīng)注意有效期和保存條件符合要求。
3．標本運輸：
標本要及時送檢，院內(nèi)運輸最好在采集后30 min內(nèi)，送檢時標本包裝容器中應(yīng)放置含凝膠的冰塊，并監(jiān)測運輸過程中的溫度。
4．標本接收與處理：
標本接收后應(yīng)及時處理，特別是痰液和口/鼻咽拭子，因為這些標本中加入了痰液液化劑或裂解液，操作時間延長將導(dǎo)致核酸的降解。
5．質(zhì)控品的使用：
試劑盒中陽性質(zhì)控品/對照品應(yīng)及時取出，放置于標本制備區(qū)的冰箱中?？蓪㈥栃詷颖镜暮怂岱盅b凍存，用作陽性對照以驗證試劑的有效性。實驗室條件允許的情況下，可將陽性標本滅活后當成陽性質(zhì)控品使用，陽性質(zhì)控應(yīng)選用濃度相對較低的標本。
6．設(shè)置充分的對照：
包括試劑對照、陰性對照和陽性對照。陰性對照可選用無菌水，每天實驗結(jié)束后配制3~5份無菌水（2 ml試管加入無菌水）分別放置于標本制備區(qū)和擴增區(qū)，用于實驗室污染控制。陰性對照和質(zhì)控品均應(yīng)與標本平行操作。
7．正確使用75%乙醇：
在實驗過程中應(yīng)合理減少75%乙醇的使用量，在操作過程中不能采用75%乙醇對空氣消毒。
8．降低氣溶膠形成風險：
標本前處理過程中動作應(yīng)輕柔，減少氣溶膠形成。
9．優(yōu)化工作流程：
操作過程合理會節(jié)省時間，可減少核酸降解；因三級防護裝備穿戴和更換比較費時，進行2019-nCoV核酸檢測宜分工合作，以避免各室間核酸污染。
10．室內(nèi)質(zhì)控方法：
在檢測一定數(shù)據(jù)后可依據(jù)本實驗室陽性率進行控制，依據(jù)二項式分布計算陽性概率，制作P控制圖，當陽性率超過控制范圍時應(yīng)停止實驗，查找原因，徹底去除污染后才能開展檢測工作。
廢棄物處理
1．人員要求：
處理廢棄物的人員必須經(jīng)過院感科或上級管理部門舉辦的生物安全培訓，取得培訓合格證書，并具備相應(yīng)的專業(yè)技能。
2．感染性廢棄物處理：
與標本接觸過的醫(yī)療廢物，如tip頭、采樣管、小離心管（如EP管）等應(yīng)用0.55%~1%含氯消毒液處理，用三層醫(yī)療廢物包裝袋（標有“感染性廢物”）裝好扎緊后轉(zhuǎn)出實驗區(qū)，經(jīng)高壓滅菌后按醫(yī)療廢物處理。防護服、鞋套、手套、口罩用75%乙醇消毒后收集于三層醫(yī)療廢物包裝袋（標有“感染性廢物”）中。經(jīng)高壓后按醫(yī)療廢物處理。
3．處理核酸的廢棄物處理：
標本提取與加樣過程中與核酸接觸過的材料，如tip頭、EP管、核酸提取槽等浸泡于稀鹽酸中，浸泡時間不少于1 h，浸泡后用醫(yī)療廢物包裝袋裝好并扎緊，經(jīng)高壓后按醫(yī)療廢物處理。
4．核酸擴增產(chǎn)物終處理：
建議擴增產(chǎn)物在專門的房間進行終處理，將浸泡于稀鹽酸中的產(chǎn)物在稀鹽酸液體中開蓋，切記不能在空氣中開蓋，浸泡過核酸的鹽酸用堿進行中和后可按醫(yī)療廢水處理，擴增用的試管，如八聯(lián)管經(jīng)高壓后按醫(yī)療廢物處理。
5．廢棄物的安全管理：
操作人員應(yīng)及時處理廢棄物，并做好登記。不得私自將廢棄物帶離實驗區(qū)。
