蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定：SEC-MALS 與傳統(tǒng)校正法（一）
溶液中蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)和行為取決于與蛋白質(zhì)的純化和構(gòu)成及其自身固有屬性相關(guān)的多種因素。 尺寸排阻色譜 (SEC) 是一種強(qiáng)大的工具，常用于分析蛋白質(zhì)的回收率、分子量和聚集性。
SEC 的工作原理涉及在樣品流經(jīng)多孔的惰性色譜柱基質(zhì)時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行分離。
較小的分子進(jìn)入填料孔內(nèi)，而較大的分子則被排除在外，因此可更快速地通過(guò)色譜柱。 結(jié)果是獲得基于流體力學(xué)體積的分離，但是人們通常要求得出分子量。
以前，通過(guò)比較未知蛋白質(zhì)與（已知分子量的）標(biāo)準(zhǔn)球狀蛋白質(zhì)的洗脫時(shí)間估算分子量，我們把這一過(guò)程稱為“傳統(tǒng)校正法”。 通常使用諸如紫外 (UV)
等單一的濃度檢測(cè)器完成上述操作。 然而，現(xiàn)在我們聯(lián)合使用光散射檢測(cè)器和濃度檢測(cè)器（紫外或折光率，RI），可不依賴保留時(shí)間測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。
這一進(jìn)步非常有用，因?yàn)樵S多蛋白質(zhì)不具有球狀結(jié)構(gòu)，使得它們測(cè)得的分子量不準(zhǔn)確。 由于增加了更多檢測(cè)器（如另一臺(tái)濃度檢測(cè)器）、特性粘度 (IV)
和動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 檢測(cè)，可極大地增加單次 SEC 測(cè)定所獲得的信息量。
Malvern SEC-MALS 20（圖 1）系統(tǒng)是一款 20 角度光散射設(shè)備，能夠不依賴于洗脫體積測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。 在此應(yīng)用說(shuō)明中，一些蛋白質(zhì)使用 SEC 進(jìn)行分離。 使用多角光散射 (MALS) 或傳統(tǒng)校正法測(cè)定它們的分子量， 并討論了這些結(jié)果的差異。
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圖 1：Viscotek SEC-MALS 20 系統(tǒng)
材料和方法
將 SEC-MALS 20 系統(tǒng)連接至使用 TDA RI 檢測(cè)器的 Viscotek
TDAmax 系統(tǒng)以測(cè)定濃度。 樣品沿 2 根 Viscotek 蛋白柱以磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行分離。 所有蛋白質(zhì)樣品均溶解在流動(dòng)相中。
使用牛血清白蛋白（一種分子量表征良好的蛋白質(zhì)）校準(zhǔn) SECMALS 20 系統(tǒng)。 使用一系列球狀蛋白質(zhì)（用于分子量為
29,000-700,000 Da 的蛋白質(zhì)的凝膠過(guò)濾標(biāo)記物試劑盒，Sigma-Aldrich）進(jìn)行色譜柱校正。
該檢測(cè)器和色譜柱均置于 30°C 環(huán)境下，以確保良好的分離效果和最佳的檢測(cè)器基線穩(wěn)定性。
結(jié)果
作為系統(tǒng)驗(yàn)證，應(yīng)經(jīng)常檢查校準(zhǔn)品，而 BSA 二聚體（通常存在于 BSA 樣品中）是一種極好的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品。 這種情況下，已正確測(cè)定二聚體的分子量，并對(duì)樣品中存在的三聚體進(jìn)行了精確測(cè)定。 BSA 色譜圖見圖 2，而 BSA 測(cè)定的結(jié)果見表 1。 圖 2 也顯示了BSA 的 SEC-MALS 色譜圖。 作為一種各向同性散射體，BSA 的峰大小和檢測(cè)器響應(yīng)在各角度均相同。 可清楚地看到各峰的分子量均非常穩(wěn)定。 這種情況預(yù)計(jì)出現(xiàn)在分子量受到嚴(yán)格控制并被認(rèn)為具有單分散性的蛋白質(zhì)中。 上述結(jié)果和分子量數(shù)值表明這些峰是 BSA 的不同寡聚體。
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圖 2：BSA 的色譜圖顯示 RI（紅色）和 SEC-MALS (90°)（桔色）檢測(cè)器信號(hào)。
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圖 3：BSA 的 SEC-MALS 20 檢測(cè)器信號(hào)色譜圖。
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技術(shù)原理
