影響蛋白質(zhì)聚集的因素有哪些？
1. 蛋白結(jié)構(gòu)
a) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)及疏水氨基酸的相對數(shù)目對蛋白質(zhì)的聚集速率和聚集體的穩(wěn)定性有較大的影響。疏水氨基酸會形成聚集傾向區(qū)域(aggregation-prone region),在特定位置引入一個新的或不同的疏水氨基酸會顯著加快蛋白聚集速率。
b) 糖基化對于許多蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義,如CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化可以穩(wěn)定CH2結(jié)構(gòu)域及整個單抗分子。因此去糖基化可能會干擾單抗的三級結(jié)構(gòu),進而加速熱誘導(dǎo)聚集。甚至蛋白質(zhì)中糖的結(jié)構(gòu)也會因為改變蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性而對蛋白質(zhì)的聚集產(chǎn)生影響。
c) 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)聚集過程中也會發(fā)揮一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)凍干誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集與β-折疊結(jié)構(gòu)有關(guān),而與非極性表面積無關(guān)。同時二級結(jié)構(gòu)也會影響巰基-二硫鍵的交換速率,進而引起分子間形成二硫鍵而導(dǎo)致聚集。
d) 蛋白的三級結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的聚集也有一定的影響。盡管聚集傾向區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)聚集有重要的影響,但若它們被適當?shù)陌?也依舊會減小蛋白質(zhì)的聚集。
2. 化學(xué)降解
蛋白質(zhì)會經(jīng)歷多種化學(xué)降解途徑,盡管許多降解途徑(如氧化、二硫鍵還原、脫氨基等)并不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,然而研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)降解可能會改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性或膠體穩(wěn)定性從而影響蛋白質(zhì)的聚集。如蛋白質(zhì)的氧化會增加聚集傾向,糖基化可將正的表面電荷轉(zhuǎn)變?yōu)橹行曰蜇撾姾?進而增加其疏水區(qū)域的暴露而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集,然而廣泛的糖基化則又會保護蛋白減少聚集體的形成。
3. 溫度
溫度通過影響蛋白質(zhì)溶液的性質(zhì)而影響蛋白質(zhì)聚集,其中包括影響蛋白質(zhì)的擴散速率、蛋白-蛋白相互作用、蛋白/聚集體溶解性、構(gòu)象穩(wěn)定性及化學(xué)降解等。溫度的升高可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分解折疊的比例的增加、增加蛋白質(zhì)擴散和碰撞速率而加速蛋白質(zhì)的聚集。同時,降低溫度也可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊,進而也會增加蛋白質(zhì)的聚集。如核糖體蛋白L9在25oC時變性程度為36%,而在4oC時該值達76%。
4. 溶液條件
蛋白質(zhì)穩(wěn)定性強烈地依賴于溶液條件。其中一個關(guān)鍵條件是溶液pH,其可以影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象和膠體穩(wěn)定性,進而影響蛋白質(zhì)的聚集。改變?nèi)芤旱膒H可以改變蛋白-蛋白相互作用的性質(zhì)和程度、蛋白質(zhì)聚集體的溶解性、以及成核和聚集體生長的速率。
另一個重要的溶液條件是離子強度,離子強度通過影響蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性以及蛋白-蛋白相互作用而影響蛋白質(zhì)的聚集。溶液離子強度的影響通常取決于溶液的pH。
此外,溶液中的陰陽離子可以通過與蛋白分子的特異或非特異性相互作用而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的聚集。在一些情況下,溶液中的陰離子會對蛋白質(zhì)的聚集具有更大程度的影響。陰陽離子對聚集影響的差異可能是由于陰離子與蛋白質(zhì)中陽性集團具有較高的結(jié)合傾向。陰離子的影響程度會在一定程度上受極化程度、蛋白溶液條件的影響。
除此之外,一些輔料或添加劑也常被用于減弱蛋白質(zhì)的聚集。然而,一些公認的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑在一定條件下也會引起蛋白質(zhì)的聚集。如研究發(fā)現(xiàn)海藻糖在高濃度(> 500 mM)下會形成分子簇,并會競爭結(jié)合蛋白質(zhì)表面的水分子,故而會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。表面活性劑如PS由于降解會形成與蛋白質(zhì)相互作用的不可溶脂肪酸、過氧化物、聚氧乙烯等而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。
5.生產(chǎn)過程
a) 凍融
凍融會引起許多蛋白質(zhì)的聚集。這是低溫導(dǎo)致的變性/結(jié)構(gòu)擾動、冰導(dǎo)致的蛋白吸附/變性、組分的選擇性結(jié)晶等一種或多種因素影響的。凍融的速度也會影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和聚集傾向。
b) 攪拌
攪拌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集主要歸因于以下一種或多種因素:更多氣液界面的形成導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附/解折疊/聚集、剪切力、暴露于疏水表面(如攪拌棒上)、簡單磨損等。剪切力導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集體會因為不同的剪切條件而產(chǎn)生不同的形貌。研究表明,搖晃小瓶中凍干的IgG1單抗會導(dǎo)致亞可見顆粒的增加及長期物理穩(wěn)定性的降低。
c) 泵送(pumping)
在樣品處理過程中使用泵時會產(chǎn)生一定的潛在剪切力、加壓/卸壓、蛋白磨損等,進而導(dǎo)致蛋白聚集。盡管研究表明一些蛋白質(zhì)可以容忍一定程度的剪切力,但是剪切力也常常是導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生顆粒、纖維化的原因。此外,泵送過程中的卸壓可能會產(chǎn)生氣泡,其也會加劇蛋白質(zhì)的聚集。
d) 光照
光照可在蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)多種光解和非光解的產(chǎn)物,這些降解產(chǎn)物中可能包括具有增強聚集傾向的聚集體或單體。研究表明,在某些情況下,抗體溶液暴露在紫外線或可見光下會形成高分子量聚集體。
e) 凍干
凍干過程會移去部分的蛋白質(zhì)水化層,這會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。許多蛋白質(zhì)在傳統(tǒng)的凍干或噴霧干燥過程中會形成聚集體,但相關(guān)機理尚未明晰。
f) 其他操作
除此之外,其他操作,如超聲或使用經(jīng)輻射滅菌的注射器也可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。前者會因為氣穴、聲壓或局部溫度升高等導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解折疊和聚集;后者會因為輻射滅菌過程中產(chǎn)生的自由基在蛋白質(zhì)長期存儲過程中會促進蛋白質(zhì)聚集體或顆粒的形成。
6. 潛在的污染物
許多來自生產(chǎn)過程或原材料中的潛在污染物也會影響蛋白質(zhì)的聚集傾向。如生產(chǎn)設(shè)備或原材料中的殘留金屬污染物會引起一些蛋白質(zhì)和多肽的聚集。殘留的消毒劑,如次氯酸、過氧乙酸可以氧化蛋白質(zhì)進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。
