與CRISPR/Cas系統(tǒng)相愛相殺的抗CRISPR蛋白研究最新進展 二
利用一種被稱作冷凍電鏡的高分辨率成像技術，這些研究人員發(fā)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)和抗CRISPR蛋白的三個重要的方面。
首先，他們準確地觀察這種CRISPR監(jiān)視復合物如何識別病毒遺傳物質以便發(fā)現(xiàn)它應當在何處發(fā)起攻擊。這種監(jiān)視復合物中的蛋白像握手那樣纏繞在細菌crRNA的周圍，讓這種crRNA的特定片段暴露出來。這種特定片段掃描病毒DNA，尋找它們能夠識別的基因序列。再者，這些研究人員分析了病毒抗CRISPR蛋白如何癱瘓這種監(jiān)視復合物。他們發(fā)現(xiàn)一種抗CRISPR蛋白覆蓋住crRNA的這個暴露片段，從而阻止這種CRISPR系統(tǒng)掃描病毒DNA。
另一種抗CRISPR蛋白采用一種不同的策略?；谶@種抗CRISPR蛋白的結合位置和負電荷，這些研究人員認為它起著模擬DNA的作用，誘導CRISPR結合這種抗CRISPR蛋白，而不是入侵的病毒DNA。
6.Science子刊：利用抗CRISPR蛋白顯著降低CRISPR-Cas9脫靶效應
doi:10.1126/sciadv.1701620
如今有研究證實病毒進化出的反制措施，即被稱作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能夠被用來改進作為一種基因治療工具的CRISPR-Cas9，從而降低可能導致不良副作用的脫靶基因編輯。
在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校和加州大學舊金山分校的研究人員證實最近發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白降低脫靶效應多達4倍，就像一種切斷開關那樣讓CRISPR-Cas9完成它的任務之后失去功能。相關研究結果發(fā)表在2017年7月12日的Science
Advances期刊上，論文標題為“Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA
mimic”。論文通信作者為加州大學伯克利分校創(chuàng)新基因組學研究所研究員Jacob
Corn博士和來自加州大學伯克利分校的作為CRISPR-Cas9基因編輯發(fā)明人之一的Jennifer A. Doudna。
在這項研究中，這些研究人員讓CRISPR-Cas9分子利用向導RNA（gRNA）發(fā)現(xiàn)、切割和替換導致鐮狀細胞疾病的血紅蛋白編碼基因突變體。他們證實一種被稱作AcrIIA4的特定抗CRISPR蛋白將這種CRISPR-Cas9分子的脫靶效應降低4倍。它在做到這一點的同時不會顯著地降低想要的在靶基因編輯。
7.Nature子刊：浙江大學朱永群實驗室揭示AcrF3蛋白抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的分子機制
doi:10.1038/nsmb.3269
AcrF3-PaCas3復合物晶體結構示意圖
2016年7月25日，國際學術權威刊物自然出版集團旗下子刊《Nature Structural & Molecular Biology》雜志上在線發(fā)表了浙江大學生命科學研究院朱永群實驗室題為“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究論文，研究揭示噬菌體蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)效應分子Cas3的分子機理。國家蛋白質科學中心的姚德強博士和朱永群實驗室博士生王小飛為論文共同第一作者，朱永群教授和助理研究員周艷博士為本文的共同通訊作者。
朱永群實驗室建立了PaCas3體外核酸酶酶學實驗體系，發(fā)現(xiàn)PaCas3具有很好的多種二價金屬離子依賴的核酸酶活性。進一步的生化實驗揭示AcrF3蛋白在溶液狀態(tài)下形成同源二聚體分子，以高親和力的方式與PaCas3特異地結合，有效地抑制了PaCas3體外核酸酶活性。通過解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3復合物的晶體結構，該研究發(fā)現(xiàn)PaCas3由一個獨立的N端Cas2結構域、HD型核酸酶結構域、SF2型解旋酶結構域(由RecA1和RecA2兩個亞結構域組成)、Long linker區(qū)以及C端結構域(CTD)所構成。單獨的Cas2蛋白被報道在CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的DNA adaptation(DNA適應)過程中發(fā)揮關鍵作用，Cas2與Cas1形成摩爾比2：4的整合酶復合物，將獲取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3擁有獨立的Cas2結構域，說明PaCas3不同于以往報道的Cas3分子，它同時參與了CRISPR-Cas系統(tǒng)中的DNA適應和DNA干擾兩個過程。
在PaCas3-AcrF3復合物晶體結構中，AcrF3以同源二聚體的方式與PaCas3的緊密結合，這與我們的生化實驗結果完全一致。單個AcrF3分子呈現(xiàn)由六股α-螺旋組成的雙層結構，并通過疏水相互作用、以反向對稱的方式形成同源二聚體分子。破壞二聚體中兩個分子之間的疏水作用，將導致AcrF3完全喪失了抑制PaCas3體外核酸酶活性的能力。在復合物結構中，AcrF3二聚體結合在PaCas3 的位于Long linker區(qū)與CTD結構域之間的凹槽區(qū)域，并與PaCas3的HD、Long linker區(qū)、RecA2和CTD結構域之間發(fā)生了廣泛的相互作用。其中，AcrF3與RecA2之間的相互作用完全封閉了PaCas3解旋酶結構域中DNA結合通道的入口，說明AcrF3的結合導致PaCas3不能接觸由Cascade呈遞來的目標DNA。令人驚訝的是，在復合物結構中，PaCas3解旋酶結構域結合了一個ADP分子，而不是通?；钚越庑附Y合的ATP分子，表明AcrF3將PaCas3鎖定在非活性的狀態(tài)。通過進一步的結構分析，該研究還發(fā)現(xiàn)AcrF3也阻止了Cascade復合物的Cse1亞基對PaCas3的識別作用，導致Cascade不能招募PaCas3。因此，AcrF3蛋白以同源二聚體為活性單元，通過屏蔽PaCas3對目標DNA的接觸、阻斷Cascade復合物Cse1亞基對PaCas3的招募作用以及將PaCas3鎖定在ADP結合的非活性狀態(tài)，從而抑制I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，發(fā)揮其anti-CRISPR活性。
8.Nature：發(fā)現(xiàn)讓細菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)失活的噬菌體基因
doi:10.1038/nature11723
在一項新的研究中，多倫多大學的Alan Davidson團隊在一項研究中，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因組中的單個原噬菌體能夠抵抗一系列其他類型的噬菌體。因此，他們對銅綠假單胞菌CRISPR系統(tǒng)進行調整以便試圖理解這種原噬菌體如何可能影響這種細菌對噬菌體感染的敏感性。他們發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的I-F型CRISPR系統(tǒng)僅僅阻止某些類型的噬菌體的感染。通過搜尋噬菌體基因組，他們發(fā)現(xiàn)5種獨特的基因，每種都有抗CRISPR活性。
9.哈工大黃志偉課題組最新Nature！揭示魔剪CRISPR“抑制開關”分子機制
doi:10.1038/nature22377
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月 28 日，哈爾濱工業(yè)大學生命學院黃志偉教授課題組在《自然》（《Nature》）在線發(fā)表了題目為《Anti-CRISPR 蛋白抑制
CRISPR-SpyCas9 活性的分子機制》（Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by
an anti-CRISPR protein）的研究論文。
早先的研究發(fā)現(xiàn)一類來自于 Listeria monocytogenes 前噬菌體的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在細胞內能夠抑制 SpyCas9 的基因編輯活性，然而這些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子機制并不清楚。
為了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能夠直接結合 SpyCas9，課題組首先建立體外生物化學研究系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn) Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接結合 SpyCas9-sgRNA 復合物，有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和結合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用，而和單獨 SpyCas9 并沒有相互作用；進一步實驗發(fā)現(xiàn) AcrIIA2 或 AcrIIA4 能夠直接抑制 SpyCas9 介導的目的 DNA 的剪切。
為了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子機制，課題組純化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 復合物，并通過結構生物學研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 復合物的晶體結構，該復合物結構揭示 AcrIIA4 蛋白構象是一個新的折疊，它結合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三個結構域形成的凹槽區(qū)域。該凹槽區(qū)域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的結合位點；另外來自 AcrIIA4 的β1 折疊片前的 Loop 與 RuvC 活性位點接觸也加強了 AcrIIA4 對 SpyCas9 的抑制作用。上述結構觀察結果顯示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 競爭性結合 SpyCas9，AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更強的親和力的實驗結果進一步支持了結構觀察的結果。接下來的生化實驗結果進一步證實 AcrIIA4 結合 SpyCas9 后抑制底物 PAM DNA 結合 SpyCas9，從而拮抗 SpyCas9 的活性。
10.Cell：首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯的“關閉開關”
doi:10.1016/j.cell.2016.11.017
CRISPR/Cas9基因組編輯正快速地引發(fā)生物醫(yī)學研究變革，但是這種新技術迄今為止并不是非常精確的。這種技術能夠在基因組中無意地產(chǎn)生過多的或者不想要的變化，產(chǎn)生脫靶突變，從而限制了它在治療應用中的安全性和療效。
如今，在一項新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院和加拿大多倫多大學的研究人員發(fā)現(xiàn)首批已知的CRISPR/Cas9活性“關閉開關”，從而為CRISPR/Cas9編輯提供更好的控制。
馬薩諸塞大學醫(yī)學院RNA治療研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多倫多大學分子遺傳學教授Alan Davidson博士和多倫多大學生物化學助理教授Karen Maxwell博士鑒定出三種自然產(chǎn)生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。這些被稱作抗CRISPR的蛋白具有阻斷Cas9切割DNA的能力
