凝膠層析法概述
凝膠層析法(gel
chromatography)也稱分子篩層析法，是指混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過凝膠層析柱時(shí)，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。該法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高，除常用于分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等物質(zhì)外，還可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，以及樣品的脫鹽和濃縮等。由于整個(gè)層析過程中一般不變換洗脫液，有如過濾一樣，故又稱凝膠過濾。
(一) 基本原理
凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，象篩子，直徑大于孔徑的分子將不能迸入凝膠內(nèi)部，便直接沿凝膠顆粒的間隙流出，稱為全排出。較小的分子在容納它的空隙內(nèi)，自由出入，造成在柱內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)。這樣，較大的分子先被洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達(dá)到相互分離的目的。洗脫時(shí)峰的位置和該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有直接的定量關(guān)系。在一根凝膠柱中，顆粒間自由空間所含溶液的體積為外水體積V。不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為V。時(shí)，出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積稱為內(nèi)水體積Vi
，能全部滲入凝膠的那些小分子，當(dāng)洗脫體積為V。+ Vi 時(shí)出現(xiàn)洗脫峰。
（二）凝膠的類型及性質(zhì)
層析用時(shí)凝膠都是三維空間的網(wǎng)狀高聚物，有一定的孔徑和交聯(lián)度。它們不溶于水，但在水中有較大的膨脹度，具有良好的分子篩功能。它們可分離的分子大小的范圍廣，相對(duì)分子質(zhì)量在102～108范圍之間。在柱層析分離中常用的凝膠 有以下幾類:
交聯(lián)葡聚糖凝膠
交聯(lián)葡聚糖凝膠的商品名稱為Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵相互交聯(lián)而形成具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。交聯(lián)葡聚糖凝膠，按其交聯(lián)度大小分成8種型號(hào)(表6–2)。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，孔徑越小，吸水膨脹就愈小，故只能分離相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)；而交聯(lián)度越小，孔徑就越大，吸水膨脹大，則可分離相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)。各種型號(hào)是以其吸水量(每g干膠所吸收的水的質(zhì)量)的10倍命名，如，Sephadex
G–25表示該凝膠的吸水量為每g干膠能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分別引入羥丙基基團(tuán)，即可構(gòu)成LH型烷基化葡聚糖凝膠。
交聯(lián)葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中較穩(wěn)定，但當(dāng)暴露于強(qiáng)酸或氧化劑溶液中，則易使糖甘鍵水解斷裂。在中性條件下，交聯(lián)葡聚糖凝膠懸浮液能耐高溫，用120℃消毒10分鐘而不改變其性質(zhì)。如要在室溫下長(zhǎng)期保存，應(yīng)加入適量防腐劑，如氯仿、疊氮鈉等，以免微生物生長(zhǎng)。
交聯(lián)葡聚糖凝膠由于有羧基基團(tuán)，故能與分離物質(zhì)中的電荷基團(tuán)(如堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用，但可借助提高洗脫液的離子強(qiáng)度得以克服。因此在進(jìn)行凝膠層析時(shí)，常用含有NaCl的緩沖溶液作洗脫液。交聯(lián)葡聚糖凝膠可用于分離蛋白質(zhì)、核酸、酶、多糖、多肽、氨基酸、抗菌素，也可用于高分子物質(zhì)樣品的脫鹽及測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。
2.瓊脂糖凝膠
瓊脂糖的商品名稱有Sepharose(瑞典)、Bio-gelA(美國(guó))、Segavac(英國(guó))、Gelarose(丹麥)等多種，因生產(chǎn)廠家不同名稱各異。瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6位脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，在溫度10O℃時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)下降至45℃以下時(shí)，它們之間相互連接成線性雙鏈單環(huán)的瓊脂糖；再凝聚即呈瓊脂糖凝膠。商品除Segavac外，都制備成珠狀瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠按其濃度不同，分為Sepharose
2B(濃度為2％)、4B(濃度為4％)及6B(濃度為6％)。Sepharose與1，3-二溴異丙醇在強(qiáng)堿條件下反應(yīng)，即生成CL型交聯(lián)瓊脂糖，其熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均有所提高，可在廣泛pH溶液(pH3～14)中使用。通常的Sepharose只能在pH4.5～9.0范圍內(nèi)使用。瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下保存易破裂，故一般均存放在含防腐劑的水溶液中。
瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性均優(yōu)于交聯(lián)葡聚糖凝膠。瓊脂糖凝膠用于柱層析時(shí)，流速較快，因此是一種很好的凝膠層析載體。
3.聚丙烯酰胺凝膠
它是由丙烯酚胺與交聯(lián)劑甲撐雙丙烯酚胺交聯(lián)聚合而成。改變單體(丙烯酚胺)的濃度，即可獲得不同吸水率的產(chǎn)物。聚丙烯酚胺凝膠的商品名稱為Bio-gel
P。該凝膠多制成干性珠狀顆粒劑型，使用前必須溶脹。聚丙烯酰胺凝膠的穩(wěn)定性不如交聯(lián)葡聚糖凝膠，在酸性條件下，其酚胺鍵易水解為羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)，一般在pH4～9范圍內(nèi)使用。實(shí)踐證明，聚丙烯酰胺凝膠層析對(duì)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定、核苷及核苷酸的分離純化，均能獲得理想的結(jié)果。
4.柱層析凝膠的選擇
在進(jìn)行凝膠層析分離樣品時(shí)，對(duì)凝膠的選擇是必須考慮的重要方面。一般在選擇使用凝膠時(shí)應(yīng)注意以下問題:
(1)混合物的分離程度主要決定于凝膠顆粒內(nèi)部微孔的孔徑和混合物相對(duì)分子質(zhì)量的分布范圍。和凝膠孔徑有直接關(guān)系的是凝膠的交聯(lián)度。凝膠孔徑?jīng)Q定了被排阻物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的下限。移動(dòng)緩慢的小分子物質(zhì)，在低交聯(lián)度的凝膠上不易分離，大分子物質(zhì)同小分子物質(zhì)的分離宜用高交聯(lián)度的凝膠。例如欲除去蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時(shí)，可選用SephadexG-25。
(2)凝膠的顆粒粗細(xì)與分離效果有直接關(guān)系。一般來說，細(xì)顆粒分離效果好，但流速慢；而粗顆粒流速快，但會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，使洗脫峰變平而寬。因此，如用細(xì)顆粒凝膠宜用大直徑的層析柱，用粗顆粒時(shí)用小直徑的層析柱。在實(shí)際操作中，要根據(jù)工作需要，選擇適當(dāng)?shù)念w粒大小并調(diào)整流速。
(3)選擇合適的凝膠種類以后，再根據(jù)層析柱的體積和干膠的溶脹度，計(jì)算出所需干膠的用量，其計(jì)算公式如下:
干膠用量/g＝πr2h/溶脹度(床體積/g干膠)。
考慮到凝膠在處理過程中會(huì)有部分損失，用上式計(jì)算得出的干膠用量應(yīng)再增加10%-20%。
(三)操作要點(diǎn)
凝膠處理
交聯(lián)葡聚糖及聚丙烯酰胺凝膠的市售商品多為干燥顆粒，使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5～10倍的去離子水中，參照表6–2及其他相關(guān)資料中凝膠溶脹所需時(shí)間，進(jìn)行充分浸泡，然后用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒，并減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡，準(zhǔn)備裝柱。在許多情況下，也可采用加熱煮沸方法進(jìn)行凝膠溶脹，此法不僅能加快溶脹速率，而且能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排除氣泡。
2．凝膠柱制備
合理選擇層析柱的長(zhǎng)度和直徑，是保證分離效果的重要環(huán)節(jié)。理想的層析柱的直徑與長(zhǎng)度之比一般為1:25～1:100。凝膠柱的裝填方法和要求，基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致，沒有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖–2000、細(xì)胞色素，或血紅蛋白等物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為2g/L的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。
3．加樣與洗脫
(1)加樣量?
加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。如果檢測(cè)方法靈敏度高或柱床體積小，加樣量可?。环駝t，加樣量增大。例如利用凝膠層析分離蛋白質(zhì)時(shí)，若采用28Onm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，對(duì)一根2cm×6Ocm的柱來說，加樣量需5mg左右。一般來說，加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高)，分辨率越高。通常樣品液的加入量應(yīng)掌握在凝膠床總體積的5％～
10％。樣品體積過大，分離效果不好。
對(duì)高分辨率的分子篩層析，樣品溶液的體積主要由內(nèi)水體積(Vi)所決定，故高吸水量凝膠如Sephadex
G-200，每mL總床體積可加0.3～0.5mg溶質(zhì)，使用體積約為0.O2倍總體積；而低吸水量凝膠如Sephadex
G–75，每mL總床體積加溶質(zhì)質(zhì)量為0.2mg，樣品體積為0.Ol倍總體積。
(2)加樣方法? 如同離子交換柱層析一樣，凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流出口，用滴管加入樣品液，打開流出口，使樣品液緩慢滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時(shí)，小心加入數(shù)mL洗脫液沖洗管壁。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。
(3)洗脫? 加完樣品后，將層析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè)儀、分部收集器及記錄儀相連，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，預(yù)先估計(jì)好一個(gè)適宜的流速，定量地分部收集流出液，每組分一至數(shù)mL。各組分可用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定性或定量分析。
凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾水。洗脫時(shí)用于流速控制的裝置最好的是恒流泵。若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進(jìn)行。
4.凝膠的再生和保存
凝膠層析的載體不會(huì)與被分離的物質(zhì)發(fā)生任何作用，因此凝膠柱在層析分離后稍加平衡即可進(jìn)行下一次的分析操作。但使用多次后，由于床體積變小，流動(dòng)速率降低或雜質(zhì)污染等原因，使分離效果受到影響。此時(shí)對(duì)凝膠柱需進(jìn)行再生處理，其方法是:先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗，再用緩沖溶液平衡，即可進(jìn)行下一次分析。
對(duì)使用過的凝膠，若要短時(shí)間保存，只要反復(fù)洗滌除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，加入適量的防腐劑即可；若要長(zhǎng)期保存，則需將凝膠從柱中取出，進(jìn)行洗滌、脫水和干燥等處理后，裝瓶保存之。
