real-timeimmuno-PCR

1992年，Sano等人將免疫測(cè)定技術(shù)與PCR結(jié)合，創(chuàng)建了一種全新的極其敏感的抗原分子檢測(cè)技術(shù)，即免疫-PCR（Immuno-PCR），隨著這種技術(shù)的不斷發(fā)展，2000年，Sim等使用熒光定量PCR代替普通PCR，發(fā)展了免疫定量PCR技術(shù)（real-timeimmuno-PCR）。

該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來，其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。

1、real-timeimmuno-PCR的基本原理

real-timeimmuno-PCR主要由兩個(gè)部分組成。第一部分是類似于普通酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的抗原抗體反應(yīng)。第二部分即熒光定量PCR。

real-timeimmuno-PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELISA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標(biāo)記抗體，用顏色反應(yīng)來表明陽性或陰性結(jié)果，而前者是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標(biāo)記抗體，用PCR擴(kuò)增抗體所連接的DNA，因此可由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量。

由于熒光定量PCR的高靈敏度，只要存在著極微量的抗原抗體反應(yīng)，都能被檢測(cè)到。real-timeimmuno-PCR的關(guān)鍵之處就在于用一個(gè)連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而將對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)核酸的定量檢測(cè)。

2、real-timeimmuno-PCR體系的組成

免疫PCR體系由待檢抗原，特異性抗體，連接分子，DNA和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)組成。

（1）待檢抗原被檢測(cè)的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，需要對(duì)免疫PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測(cè)吸附性差的抗原。

免疫PCR的后續(xù)過程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是專門用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡化實(shí)驗(yàn)過程和提高檢測(cè)的精確性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測(cè)微量抗原。

（2）特異抗體免疫PCR中的特異性是對(duì)應(yīng)于待測(cè)抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過親和素再結(jié)合DNA。

（3）連接分子連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白A(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來連接生物素標(biāo)記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識(shí)別DNA上的生物素，蛋白部分可識(shí)別抗體的Fc段。

（4）DNA和PCR系統(tǒng)免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測(cè)抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是借助了PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力。

免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。

DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的dATP或dUTP通過聚合酶標(biāo)記在DNA分子上，一般是1個(gè)分子DNA標(biāo)記2個(gè)生物素，標(biāo)記率可達(dá)百分之百。免疫PCR的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。

一種新的高靈敏度的葡萄球菌腸毒素A(SEA)的檢測(cè)方法――定量免疫PCR

摘要：葡萄球菌腸毒素是細(xì)菌超抗原蛋白家族中的一種多肽，除了天然的超抗原性外，它還是腸胃毒素蛋白，嚴(yán)重危害人的健康。由于現(xiàn)在常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法在靈敏度和特異性方面不高，因此需要建立一種新的高靈敏度方法用于檢測(cè)葡萄球菌腸毒素（SE）抗原。