熒光原位雜交(fluorescence??in? situ??hybridiza- tion, FISH)技術(shù)開發(fā)于20世紀(jì)80年代, 是植物細(xì)胞遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的重要工具, 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定基因組區(qū)域或整條染色體相關(guān)DNA的可視化觀察。用于設(shè)計(jì)FISH探針的DNA序列往往是染色體上的重復(fù)序列元件或者細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chro- mosome, BAC)等基因組DNA克隆(Jiang and Gill, 2006)。過去30多年, 這些探針作為染色體識(shí)別的重要工具已經(jīng)在植物研究中獲得了廣泛應(yīng)用, 幫助解決單個(gè)染色體甚至整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、組成、突變、傳遞和演化等關(guān)鍵問題(Cheng? et? al.,? 2002;? Jiang, 2019; 程新杰等, 2019)。然而, 這些常規(guī)探針也存在缺點(diǎn), 在一定程度上限制了FISH技術(shù)的發(fā)展。首先,開發(fā)出一套能夠識(shí)別某個(gè)物種所有染色體的探針需要耗費(fèi)研究人員巨大的精力; 并且, 基于重復(fù)序列的探針只能標(biāo)記染色體的特定區(qū)域, 因此并不能用于識(shí)別和區(qū)分不同基因型的相同染色體或近緣物種的部分同源染色體; 此外, 小麥(Triticum aestivum)等基因組較大的物種通常包含很大比例的DNA重復(fù)序列,

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這意味著這些物種的BAC克隆并不能被開發(fā)為染色體特異的FISH探針(Han et al., 2015)。

染色體涂染是FISH技術(shù)中的一種, 其通過染色體特異的探針來識(shí)別染色體特定區(qū)域或整條染色體。然而, 由于缺乏染色體特異的DNA探針, 對(duì)于大多數(shù)植物物種來說, 追蹤單條染色體難以實(shí)現(xiàn)?；贐AC克隆的染色體涂染技術(shù)要求植物的基因組小且重復(fù)序列少, 目前只在擬南芥(Arabidopsis?thaliana)和二穗短柄草 (Brachypodium? distachyon) 中成功應(yīng)用(Lysak et al., 2001; Idziak et al., 2011)。染色體涂染的另一種策略是通過PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建單拷貝序列庫(kù)(Lou et al., 2014), 但對(duì)于基因組龐大而復(fù)雜的物種而言, 擴(kuò)增覆蓋整條染色體的大量PCR產(chǎn)物也非常困難和耗時(shí)。

寡核苷酸熒光原位雜交(oligonucleotide fluores- cence?in situ?hybridization, Oligo-FISH)技術(shù)快速發(fā)展成為植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的新一代染色體涂染技術(shù)。早期的寡核苷酸探針受到DNA合成成本高、通量低的限制, 無法廣泛應(yīng)用。近年來, 得益于DNA高通量合成技術(shù)的快速發(fā)展, Oligo-FISH技術(shù)首先被開 發(fā) 并 應(yīng) 用 于 小 鼠 (Mus?? musculus) 和 果 蠅(Drosophila melanogaster)的染色體結(jié)構(gòu)變異研究中(Boyle et al., 2011; Yamada et al., 2011; Beliveau et al., 2012)。在植物中, 2015年Oligo-FISH被成功應(yīng)用于黃瓜(Cucumis?sativus)及其同屬植物的染色體結(jié)構(gòu)與演化研究(Han? et al., 2015),? 開啟了Oligo- FISH在植物染色體研究中的熱潮。Oligo-FISH適用于所有具有參考基因組的植物物種, 目前已成功應(yīng)用于黃瓜、草莓(Fragaria vesca)、馬鈴薯(Solanum tu- berosum)、水稻(Oryza sativa)、楊樹(Populus tomen- tosa) 、甘蔗(Saccharum??spontaneum) 和玉米(Zea mays)等物種(Han et al., 2015; Qu et al., 2017; Braz et al., 2018; He et al., 2018; Hou et al., 2018; Meng et al., 2018; Xin et al., 2018; Albert et al., 2019)。

與常規(guī)FISH探針相比, 寡核苷酸探針具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先, 可根據(jù)需求設(shè)計(jì)并合成覆蓋所有染色體組、整條染色體或染色體區(qū)段的探針, 因此Oligo- FISH可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同染色體及染色體片段的精準(zhǔn)識(shí)別。其次, 根據(jù)不同亞種或不同種之間的保守序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針, 可用于識(shí)別來自不同物種或亞種的部分同源染色體(Han et al., 2015; He et al., 2018; Hou et al., 2018; Liu et al., 2020)。同時(shí), 通常300 ng的寡核苷酸庫(kù)可以被擴(kuò)增和標(biāo)記為足夠1×106個(gè)FISH實(shí)驗(yàn)使用的探針, 因此每個(gè)合成的寡核苷酸庫(kù)基本上可以用作標(biāo)記FISH探針的永久資源(Han et al., 2015)。此外, 通過生物信息學(xué)分析和人工設(shè)計(jì), 可去除非特異重復(fù)序列, 避免產(chǎn)生FISH雜交背景, 極大地降低了實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難度(Liu and Zhang, 2021)。

由于具有常規(guī)探針無法比擬的優(yōu)勢(shì), Oligo-FISH技術(shù)極大地拓展了FISH在植物研究中的應(yīng)用。通過設(shè)計(jì)覆蓋整條染色體的寡核苷酸探針, 可以精確識(shí)別并追蹤整條染色體, 從而開展減數(shù)分裂期同源染色體的配對(duì)分析(Zhang et al., 2017, 2020; He et al., 2018)。針對(duì)染色體某個(gè)或者幾個(gè)較小的區(qū)段設(shè)計(jì)探針并開發(fā)的Oligo-FISH barcode技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)每條染色體的識(shí)別和區(qū)分, 從而開展精確的核型分析和比較研究(Braz et al., 2018)。通過檢測(cè)Oligo-FISH雜交信號(hào)的強(qiáng)弱和有無, 可以鑒定某個(gè)物種與其它物種的親緣關(guān)系, 開展遺傳適應(yīng)和種群演化研究; 同時(shí)也可識(shí)別易位等染色體變異并確定染色體斷點(diǎn)的精確位置(Han

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et al., 2015; Hou et al., 2018; Albert et al., 2019; Braz et al., 2020; Liu et al., 2020; Do Vale Martins et al., 2021; Shi et al., 2022)。根據(jù)不同單倍型染色體的序列差異, 可設(shè)計(jì)單倍型特異的寡核苷酸探針,進(jìn)而在減數(shù)分裂中期染色體上直接觀察到雜交后代減數(shù)分裂發(fā)生交換的位置和數(shù)目, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)種間雜種乃至種內(nèi)雜種單倍型的識(shí)別與分析(Do Vale Mar- tins et al., 2019)。此外, Oligo-FISH技術(shù)還可應(yīng)用于檢測(cè)基因組拼接質(zhì)量、分析異源多倍體的染色體和識(shí)別亞基因組等(Xin et al., 2018; Shi et al., 2022; Yu et al., 2022)。

本文將詳述寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增和標(biāo)記步驟,? 并以模式植物水稻為例介紹染色體的制備和FISH實(shí)驗(yàn)方法。

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1???????材料和試劑

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1.1??????寡核苷酸庫(kù)

寡核苷酸庫(kù)(MYtags? immortal? oligonucleotide? lib- rary, 每庫(kù)約300 ng)由Arbor Biosciences?公司(前身為MYcroarray?, 美國(guó))合成。每個(gè)合成的寡核苷酸序列都包含45 nt的染色體序列、5′正向引物序列(T7 RNA 聚合酶啟動(dòng)子序列) 和3′ 反向引物序列。用nuclease-free水或10 mmol·L–1? Tris-HCl (pH7.5)重懸寡核苷酸庫(kù), 將其溶解為1 ng·μL–1的原液, 存儲(chǔ)于–80°C冰箱。吸取2 μL寡核苷酸庫(kù)的原液于26 μL nu- clease-free水中, 制備成工作液, 存儲(chǔ)于–20°C冰箱。Arbor Biosciences?公司也會(huì)提供用于MYcroarray脫泡PCR的引物(MYtags PCR primer mix, 包括5′正向引物和3′反向引物), 需將其保存于–20°C冰箱。

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1.2??????MYcroarray脫泡PCR

所用材料和試劑包括高保真DNA聚合酶預(yù)混液(KAPA HiFi HotStart Ready Mix, Cat No.KK2801)、PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen Qiaquick PCR purification Kit, Cat No.28106)和醋酸鈉溶液(3 mol·L–1, pH5.2)。

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1.3??????體外轉(zhuǎn)錄

所用材料和試劑包括轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen MEGA- shortscript? T7 Kit, Cat No.AM1354)、RNA純化試劑盒(Qiagen RNeasy Mini Kit, Cat No.74903)和無水乙醇。

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1.1??????反轉(zhuǎn)錄

訂購(gòu)帶熒光標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄引物, 序列如下: 5′-地高辛或生物素-CGTGGTCGCGTCTCA-3′ (由生工公司合成, 序列與MYcroarray脫泡PCR的3′反向引物一致),溶 解 濃 度 為 1 mmol·L–1?。 其 余 試 劑 盒 材 料 包 括10 mmol·L–1? dNTP、RNA酶抑制劑(Invitrogen SU- PERasel In? RNase Inhibitor, 20 U·μL–1, Cat No.- AM2694) 、反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen? SuperScript?? IV Reverse Transcriptase, 200 U·μL–1, Cat No.1809- 0050)、核酸外切酶(Exonuclease I enzyme, 20 U·μL–1, New England Biolabs, Cat No.M0293S)、0.5 mol·L–1?EDTA (pH8.0)、RNA純化試劑盒(Quick-RNA Mini- Prep Kit, Zymo Research, Cat No.R1055)以及無水乙醇。

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1.2??????去除RNA

試劑和材料包括RNase H (5 U·μL–1, New England Biolabs, Cat No.M0297L)、RNase A (10 mg·mL–1, Thermo Fisher Scientific, Cat No.EN0531)、RNA純化試劑盒(Quick-RNA MiniPrep Kit, Zymo Research, Cat No.R1055)和無水乙醇。

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1.3??????染色體制備

(1)?? 卡諾固定液: 將無水乙醇與冰醋酸按照3:1的體積比進(jìn)行配制。

(2)? 45%醋酸溶液: 取45 mL冰醋酸, 與55 mL去離子水混合, 混勻后室溫放置。

(3)?? 1%醋酸洋紅染液: 將1.0 g洋紅粉末溶于100 mL 45%醋酸中, 小火煮沸8小時(shí), 然后放在冰上快速冷卻, 室溫保存。

(4)? 2 mmol·L–1? 8-羥基喹啉溶液: 取0.29 g 8-羥基喹啉粉末溶于少量無水乙醇中, 待完全溶解后用去離子水定容至1 L。

(5)?? 酶混合液: 將2 g纖維素酶(Yakult Pharmaceuti- cal)和1 g果膠酶(Plant Media)溶于100 mL 1× PBS溶液中, 分裝后于–20°C冰箱保存。

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1.4??????FISH實(shí)驗(yàn)

(1)? PBS溶液。10× PBS: 將80.0 g NaCl、2.0 g KCl、

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14.4 g Na2HPO4和2.4 g KH2PO4溶于900 mL去離子水中, 用1 mol·L–1? HCl將pH值調(diào)至7.4, 再用去離子水定容至1 L,? 室溫保存;? 1×? PBS溶液:? 取100 mL 10× PBS溶液, 用去離子水定容至1 L, 4°C保存。

(2)?? 4%多聚甲醛固定液: 稱量4.0 g多聚甲醛粉末溶于95 mL 1× PBS溶液中, 在燒杯中攪拌混勻, 蓋上燒杯, 加熱溶解(溫度不超過65°C),? 滴加1? mol·L–1?NaOH, 直至溶液澄清, 置于冰上降溫。用1 mol·L–1?HCl將pH值調(diào)至7.4。用1× PBS溶液將體積定容至100 mL, 于4°C冰箱保存。

(3)?? SSC溶液。20× SSC: 將175.3 g NaCl和88.2 g檸檬酸鈉溶于900 mL去離子水中, 用少量濃鹽酸調(diào)pH值至7.0, 然后定容至1 L, 室溫保存; 2× SSC: 取100 mL 20× SSC溶液, 用去離子水定容至1 L。

(4)? 70%甲酰胺溶液: 將7 mL100%去離子化甲酰胺、1 mL 20× SSC和2 mL去離子水混合, 用錫箔紙包裹,于4°C冰箱保存。

(5)? 50%硫酸葡聚糖: 將2.5 g硫酸葡聚糖溶于5 mL去離子水中, 分裝于1.5 mL EP管中, 取1管置于4°C冰箱備用, 其余放于–20°C冰箱中保存。

(6) 0.1% PBST溶液: 取100 μL Tween-20溶于100 mL 1× PBS溶液中, 混勻, 于4°C冰箱中保存。

(7)? 100%去離子化甲酰胺。

(8)? 70%乙醇和無水乙醇。

(9)?? 抗體: 使用偶聯(lián)熒光素的抗地高辛(Anti-dig-rho- damine,? Roche,? Cat? No.11207750910) 或生物素(Anti-biotin-FITC, SouthernBiotech, Cat No.6404-02)抗體。

(10)? DAPI染液: 將10 mg DAPI溶解于10 mL去離子水中, 制備成儲(chǔ)存原液(1 mg·mL–1), 分裝后存儲(chǔ)于–20°C冰箱。DAPI工作液的配制方法如下: 吸取10 μL DAPI 儲(chǔ)存原液于1? mL 抗淬滅劑(ProLong,? Invitro- gen, Cat No.P36984)中, 終濃度為10 μg·mL–1, 于–20°C冰箱中保存。

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2???????儀器和生物信息學(xué)工具

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2.1??????實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器包括PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、恒溫烘箱、水平震蕩儀、酒精燈和移液器等。

1.1??????生物信息學(xué)工具及數(shù)據(jù)要求

(1)?? 操作系統(tǒng):? Chorus2 軟件可以在Unix? (MacOS/

Linux)和Windows平臺(tái)上運(yùn)行, 建議在Linux上操作。

(2)?? 程序包: Cython、numpy、pyfasta、primer3-py、pandas和pybigwig (Chorus2的GUI版本需要matplot- lib和PyQt5兩個(gè)額外的程序包)。

(3)?? 其它生物信息學(xué)工具: BWA用于全基因組比對(duì); Jellyfish用于k-mer計(jì)算。

(4)?? 需下載的數(shù)據(jù): 水稻參考基因組和全基因組測(cè)序(whole genome sequencing, WGS)數(shù)據(jù)。推薦使用> 5X深度的WGS數(shù)據(jù)用于過濾重復(fù)序列。

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2???????實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

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Oligo-FISH主要包括3個(gè)步驟: (1) 寡核苷酸序列的設(shè)計(jì)和合成; (2) 探針的擴(kuò)增和標(biāo)記; (3) FISH實(shí)驗(yàn)。寡核苷酸序列可以使用Chorus2軟件進(jìn)行設(shè)計(jì) (https://

github.com/zhangtaolab/Chorus2)? (Zhang? et? al., 2021)。設(shè)計(jì)思路如下: 基因組序列已知的某物種某條染色體的某個(gè)區(qū)域(或整條染色體)上的序列, 通過計(jì)算被分成45? nt 的寡核苷酸片段,? 其中dTm 大于

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10°C并且只有1個(gè)拷貝(即不存在重復(fù)序列)的特異序列將用于探針設(shè)計(jì)。這些寡核苷酸序列均勻覆蓋目標(biāo)染色體區(qū)域, 從而產(chǎn)生均一的染色體涂染信號(hào)。在體細(xì)胞有絲分裂中期高度濃縮的染色體上, 寡核苷酸的分布密度為每kb 0.1–0.5個(gè)就足以產(chǎn)生較好的染色體信號(hào)(Jiang, 2019)。由于減數(shù)分裂粗線期的染色體延伸較長(zhǎng), 因此需要更高密度的寡核苷酸。例如, 水稻9號(hào)染色體探針的寡核苷酸的分布密度為每kb 2 個(gè)(Hou et al., 2018)。將這些選定的寡核苷酸序列合成為庫(kù), 經(jīng)過兩步擴(kuò)增過程(脫泡PCR和體外轉(zhuǎn)錄)、一步探針標(biāo)記過程(反轉(zhuǎn)錄)和探針純化(RNA去除), 獲得用于Oligo-FISH 的ssDNA探針;? 隨后經(jīng)過染色體制備和變性、探針雜交和抗體反應(yīng)等FISH實(shí)驗(yàn)流程,最終獲得目標(biāo)染色體區(qū)域的熒光涂染信號(hào)。具體實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

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3???????實(shí)驗(yàn)方法

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3.1??????寡核苷酸探針設(shè)計(jì)

4.1.1??????Chorus2軟件安裝

Chorus2使用python3語(yǔ)言編寫, 利用Anaconda3可

直接安裝Chorus2。最新的64位Linux版本Anaconda3可 從 網(wǎng) 站 (https://www.anaconda.com/products/in- dividual)下載。Chorus2軟件的安裝過程參考Chorus2網(wǎng)站(https://chorus2.readthedocs. io/en/latest/)上的操作流程和安裝視頻。

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4.1.1?????使用Chorus2軟件設(shè)計(jì)寡核苷酸探針

(1)?? 寡核苷酸序列初篩。以參考基因組和目標(biāo)序列作為輸入文件, 其中目標(biāo)序列可以是染色體的某個(gè)區(qū)域或整條染色體或整個(gè)基因組。通過Chorus2軟件的參數(shù)設(shè)定分析結(jié)果的存儲(chǔ)位置、用于脫泡PCR的反向引物序列、探針長(zhǎng)度、探針與目標(biāo)序列的最小同源性和dTm值等。經(jīng)過初篩, Chorus2輸出2個(gè)文件, 一個(gè)包含從基因組中過濾到的所有寡核苷酸序列, 另一個(gè)包含不重疊的寡核苷酸序列。

(2)?? 使用ChorusNGSfilter 過濾寡核苷酸集合中的重復(fù)序列。將WGS數(shù)據(jù)、參考基因組和初篩到的寡核苷酸序列作為輸入文件, 使用基于k-mer方法的Cho- rusNGSfilter進(jìn)一步過濾重復(fù)序列。使用Jellyfish計(jì)算k-mer值, 用來代表每個(gè)寡核苷酸的相對(duì)重復(fù)次數(shù)。

(3)?? 使用ChorusNGSselect 選擇可信的寡核苷酸探針。根據(jù)每個(gè)寡核苷酸的k-mer值, 使用ChorusNGS- select選擇探針。如果某個(gè)寡核苷酸序列的k-mer值偏離k-mer 值分布的總區(qū)間, 則該寡核苷酸將被過濾掉。為了方便探針設(shè)計(jì), Chorus2采用名為ChorusGUI的圖形用戶界面。使用ChorusPBGUI腳本, 根據(jù)給定的探針密度或目標(biāo)鏈, 可以輕松選出最終的寡核苷酸探針集合。將這些選定的寡核苷酸序列合成為庫(kù), 即可用于后續(xù)的探針擴(kuò)增和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。

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1.1?????MYcroarray脫泡PCR及PCR產(chǎn)物純化(第1步擴(kuò)增)

4.2.1?????MYcroarray脫泡PCR

(1)?? 準(zhǔn)備模板混合液(冰上操作)。吸取24.7 μL去離子水、0.25 μL MYtags PCR primer mix和25 μL高保真DNA聚合酶預(yù)混液(KAPA HiFi HotStart Ready Mix)于0.2 mL PCR管中, 混勻后短暫離心。

(2)?? 另準(zhǔn)備1個(gè)新的0.2 mL PCR管, 吸入5 μL模板混合液, 作為陰性對(duì)照。

(3)?? 取2.5 μL寡核苷酸庫(kù)工作液, 加入剩余的模板混合液中, 混勻后短暫離心。

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(4)?? 將第(3)步中的PCR混合液和第(2)步中的陰性對(duì)照放入PCR儀。PCR反應(yīng)程序如下: 95°C3分鐘, 4個(gè)循環(huán); 98°C20秒, 54°C15秒, 72°C30秒, 14個(gè)循環(huán); 98°C20秒, 56°C15秒, 72°C30秒。反應(yīng)結(jié)束后于24°C暫存。

(5)?? 再取1個(gè)新的0.2 mL PCR管, 用于準(zhǔn)備脫泡混合液(冰上操作)。取8.8 μL去離子水、1.2 μL MYtags PCR primer mix和10 μL高保真DNA聚合酶預(yù)混液(KAPA HiFi HotStart Ready Mix), 混勻后短暫離心。

(6)?? 將配好的脫泡混合液加入第(4)步中的PCR混合液中, 放入PCR儀。PCR反應(yīng)程序如下: 95°C3分鐘, 1個(gè)循環(huán); 98°C20秒, 56°C15秒, 72°C30秒。反應(yīng)結(jié)束后, 在PCR純化前, 存放于24°C環(huán)境。

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4.2.2??????PCR產(chǎn)物回收

(1)?? 使用Qiagen Qiaquick PCR純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將4.2.1節(jié)第(6)步中的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中, 加入適量nuclease-free水, 定容至100 μL,加入5 μL 3 mol·L–1醋酸鈉溶液。

(2)?? 加入500 μL Qiagen PB溶液, 震蕩5秒。

(3)?? 將所用溶液轉(zhuǎn)移到QIAquick柱上, 并安裝在2 mL收集管上,? 16? 000? ×g?離心1 分鐘。棄流穿液,? 將QIAquick柱放回同一收集管上。

(4)?? 向QIAquick 柱中加入700? μL? Qiagen? PE溶液, 16 000 ×g離心1分鐘。棄流穿液, 將QIAquick柱放回同一收集管上。

(5)? 16 000 ×g再次離心2分鐘。

(6)?? 將QIAquick柱放于1.5 mL EP管上, 在膜中央加入30 μL Qiagen EB溶液, 靜置4分鐘, 16 000 ×g離心1分鐘。

(7)?? 使用分光光度計(jì)測(cè)量回收DNA的濃度(見注意事項(xiàng)1)。于–20°C冰箱保存。

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1.2??????體外轉(zhuǎn)錄和RNA純化(第2步擴(kuò)增)

4.3.1??????體外轉(zhuǎn)錄

(1)?? 使用MEGA shortscript? T7轉(zhuǎn)錄試劑盒, 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄混合液(冰上操作)。取?1個(gè)RNase-free的0.2 mL PCR管, 向其中加入X μL 4.2.2節(jié)第(7)步回收所得的DNA (總量至少480? ng), 4 μL? 10×? T7反應(yīng)溶液, 16 μL rNTP (包括ATP、CTP、GTP和UTP), 4 μL T7酶, 用nuclease-free水補(bǔ)足至40 μL, 混勻后短暫離心。

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(2)?? 將PCR管放于PCR儀中, 37°C孵育4小時(shí), 熱蓋溫度為42°C。所得產(chǎn)物即為體外轉(zhuǎn)錄而成的RNA, 可立即進(jìn)行下一步回收, 亦可于–80°C冰箱中保存。

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4.3.2?????RNA純化

(1) 使用Qiagen RNeasy Mini試劑盒回收RNA。將4.3.1節(jié)第(2)步所得產(chǎn)物放于冰上, 轉(zhuǎn)移到1.5? mL EP管中, 加入260 μL RNase-free水, 使用移液器吸打混勻?？傮w積為300 μL, 分裝為3管, 每管100 μL。

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液、10 μL? 0.1? mol·L–1?? DTT和1 μL RNA酶抑制劑SUPERasel-In, 混合后將其轉(zhuǎn)移到上一步中的反轉(zhuǎn)錄混合液中, 混勻后短暫離心。

(4)?? 將PCR管放入PCR儀中, 55°C孵育5分鐘, 熱蓋溫度為55°C。

(5)?? 向上一步反應(yīng)液中加入3? μL 反轉(zhuǎn)錄酶Super- Script IV, 混勻后短暫離心。

(6)?? 將PCR管放入PCR儀中, 55°C孵育1小時(shí), 熱蓋溫度為55°C。

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(2)?? 向每管加入350 μL RLT溶液, 充分混勻。再加入?????? (7) 為了去除多余的引物, 向其中加入11 μL Exonu-

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250 μL無水乙醇, 充分混勻, 勿離心。

(3)?? 取650 μL上述混合液轉(zhuǎn)移到RNeasy mini spin柱中, 并置于2 mL收集管上, 13 500 ×g離心1分鐘。棄流穿液, 將RNeasy mini spin柱放回到同一收集管上。重復(fù)這一步驟, 直到所有混合樣用完。

clease I反應(yīng)溶液和2 μL Exonuclease I, 混勻后短暫離心。

(8)?? 將PCR管放入PCR儀中, 37°C孵育15分鐘, 熱蓋溫度為105°C。

(9)?? 加入12 μL 0.5 mol·L–1?EDTA (pH8.0), 混勻后短

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(4)?? 吸取500 μL RPE溶液于RNeasy mini spin柱中, 13 500? ×g離心1分鐘,? 棄流穿液,? 將RNeasy? mini spin柱放回到同一收集管上。

(5)?? 重復(fù)第(4)步。

(6)?? 將RNeasy mini spin柱放回到同一收集管上, 再次13 500 ×g離心3分鐘。

(7)?? 將RNeasy mini spin柱放于1.5 mL EP管上, 在其中一個(gè)柱子膜中央加入50 μL RNase-free水, 靜置4分鐘, 13 500 ×g離心1分鐘。再用洗脫下來的50 μL RNA溶液依次洗脫另外2個(gè)柱子(即將3個(gè)柱子中的RNA都洗脫到此50 μL水中)。

(8)?? 使用分光光度計(jì)測(cè)量回收RNA的濃度(見注意事項(xiàng)2), 于–80°C冰箱中保存(見注意事項(xiàng)3)。

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1.3??????反轉(zhuǎn)錄及產(chǎn)物回收(探針標(biāo)記)

4.4.1?????反轉(zhuǎn)錄

(1)?? 準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄混合液(冰上操作)。取?1個(gè)RNase-free的0.2 mL PCR管, 向其中加入X μL 4.3.2節(jié)第(8)步回收的RNA (42 μg)、2.4 μL 1 mmol·L–1地高辛或生物素標(biāo)記的反轉(zhuǎn)錄引物、15 μL 10 mmol·L–1?dNTP和1 μL RNA酶抑制劑SUPERasel-In, 用nuclease-free水補(bǔ)足體積至60 μL, 混勻后短暫離心。

(2)?? 將PCR管放入PCR儀中, 65°C孵育5分鐘, 熱蓋溫度為75°C。結(jié)束后立即取出, 置于冰上冷卻5分鐘。

(3)?? 再取1個(gè)新的RNase-free的0.2 mL PCR管(冰上操作), 加入4 μL nuclease-free水、20 μL 5× RT溶

暫離心。

(10) 將PCR管放入PCR儀中, 80°C孵育20分鐘, 熱蓋溫度為105°C, 隨后將樣品置于冰上。

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4.4.2??????反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA-DNA雜合體)的回收

(1)?? 使用Zymo Quick-RNA MiniPrep試劑盒, 向反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中加入500 μL Zymo RNA裂解液, 震蕩5秒。

(2)?? 再加入625 μL無水乙醇, 震蕩5秒。

(3)?? 將Zymo-Spin柱安裝于2 mL收集管上, 向柱中加入500 μL上一步的樣品。16 000 ×g離心30秒。棄流穿液, 將Zymo-Spin柱放回到同一收集管上。重復(fù)這一步驟, 直到所有樣品用完。

(4)?? 向Zymo-Spin柱中加入400 μL Zymo RNA Prep溶液, 16 000 ×g離心30秒。棄流穿液, 將Zymo-Spin柱放回到同一收集管上。

(5)?? 向Zymo-Spin柱中加入700 μL Zymo RNA wash溶液, 16 000 ×g離心30秒。棄流穿液, 將Zymo-Spin柱放回到同一收集管上。

(6)?? 再向Zymo-Spin 柱中加入400? μL? Zymo? RNA wash 溶液,? 16? 000? ×g?離心30 秒。棄流穿液,? 將Zymo-Spin柱放回到同一收集管上。

(7)?? 再16 000 ×g離心3分鐘。

(8)?? 將Zymo-Spin柱放于1個(gè)新的1.5 mL EP管上, 向膜中央加入42 μL nuclease-free水, 室溫靜置4分鐘, 16 000 ×g離心1分鐘。

(9)?? 重復(fù)步驟(8):? 再向Zymo-Spin 柱的膜中央加入

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42 μL nuclease-free水, 室溫靜置4分鐘, 16 000 ×g???? 4.6???染色體制備

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離心1分鐘。

(10)?? 回收的總反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約為82 μL, 于–80°C冰箱保存。

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1.4??????RNA去除和ssDNA探針純化

4.5.1?????RNA去除

(1)?? 準(zhǔn)備去除RNA 的酶混合液( 冰上操作) 。取1 個(gè)0.2 mL的PCR管, 向其中加入6 μL nuclease-free水、10 μL 10× RNase H溶液和4 μL RNase H (5 U·μL–1)。

(2)?? 將上述酶混合液加入到回收的82 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中, 混勻后短暫離心。

(3)?? 放入PCR 儀中,? 37°C 孵育2 小時(shí),? 熱蓋溫度為105°C。反應(yīng)結(jié)束后無需放于冰上。

4.6.1???水稻減數(shù)分裂染色體的制備

(1)?? 將處于減數(shù)分裂階段的水稻幼穗收集于10 mL試管中,? 用新鮮配制的卡諾固定液浸沒,? 立即置于–20°C冰箱中存儲(chǔ)(可存數(shù)月)。

(2)?? 在染色體制備前12小時(shí)將存于–20°C冰箱的水稻幼穗取出, 于室溫固定(見注意事項(xiàng)5)。

(3)?? 取1朵穎花, 將其放至載玻片上, 用尖頭鑷子和解剖針將穎花中的6枚花藥剝離出來, 向花藥上滴加1滴醋酸洋紅染液。

(4)?? 將6枚花藥在醋酸洋紅溶液中分散開, 用解剖針逐個(gè)擠壓每個(gè)花藥1–2次, 用22 mm × 22 mm蓋玻片覆蓋花藥及醋酸洋紅溶液。

(5)??? 在 40 倍 相 差 顯 微 鏡 (OLYMPUS,? BX41-PHD-

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(4)?? 再向其中加入4 μL

后短暫離心。

10 mg·mL–1? RNase A, 混勻

P11)下觀察染色體形態(tài), 從而判斷所觀察穎花中的花粉母細(xì)胞所處的減數(shù)分裂時(shí)期(見注意事項(xiàng)6)。

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(5)?? 放入PCR 儀中,? 程序如下:? 37°C 孵育60 分鐘, 70°C孵育20分鐘, 50°C孵育60分鐘, 95°C孵育5分鐘(從95°C梯度降溫到50°C, 0.1°C·s–1), 50°C再次孵育60分鐘, 隨后4°C孵育直至純化。

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4.5.2?????ssDNA探針純化

(1)??? 使用 Zymo? Quick-RNA? MiniPrep 試劑盒純化ssDNA 探針 ,? 在 4.5.1 節(jié)第 (5) 步混合溶液中加入400 μL Zymo RNA裂解液, 震蕩5秒。

(2)?? 再加入500 μL無水乙醇, 震蕩5秒。

(3)?? 將Zymo-Spin柱安放于2 mL收集管上, 向柱中加入650 μL上述樣品。16 000 ×g離心30秒。棄流穿液,將Zymo-Spin柱放回到同一收集管上。重復(fù)這一步驟,直到所有樣品用完。

(4)?? 同4.3.2節(jié)中第(4)–(7)步。

(5)?? ssDNA探針洗脫。將Zymo-Spin柱放于1個(gè)新的1.5 mL EP管上, 向膜中央加入50 μL預(yù)熱至65°C的nuclease-free水, 靜置4分鐘, 16 000 ×g離心1分鐘。

(6)?? 重復(fù)步驟(5):? 再向Zymo-Spin 柱的膜中央加入50 μL 預(yù)熱至65°C 的nuclease-free 水,? 靜置4 分鐘, 16 000 ×g離心1分鐘。

(7)?? 使用分光光度計(jì)測(cè)量回收ssDNA探針的濃度(見注意事項(xiàng)4), 隨后放于–20°C冰箱儲(chǔ)存。FISH實(shí)驗(yàn)前將其取出并放冰上融化。

(6)?? 脫色。將45%醋酸溶液滴于蓋玻片左側(cè), 將濾紙放于蓋玻片右側(cè)吸取, 待左側(cè)45%醋酸溶液被完全吸取后, 再補(bǔ)滴1–2次, 直至醋酸洋紅染液洗脫干凈。

(7)?? 將載玻片翻轉(zhuǎn)過來, 蓋玻片一面向下, 放于濾紙上, 左右手分別置于蓋玻片兩側(cè), 用力向下擠壓。

(8)?? 用長(zhǎng)柄鑷子夾取載玻片, 將其浸沒在液氮中, 冷凍幾秒直至無聲, 然后拿出載玻片放于桌面, 用刀片快速去掉蓋玻片。

(9)?? 將載玻片放空氣中干燥, 即可用于后續(xù)的FISH實(shí)驗(yàn), 也可將涂片置于–20°C冰箱暫存數(shù)周。

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4.6.2???水稻根尖細(xì)胞染色體制備

(1)?? 將水稻種子去殼后放在鋪有幾層濕濾紙的培養(yǎng)皿中, 37°C培養(yǎng)2天, 直到種子萌發(fā)并長(zhǎng)出1–2 cm的根(或直接取大田生長(zhǎng)的水稻根)。

(2)?? 根的預(yù)處理。用解剖刀將長(zhǎng)1–2 cm的根取下, 放于2 mmol·L–1?8-羥基喹啉溶液中, 20°C孵育2小時(shí)。

(3)?? 固定。將預(yù)處理后的根放于新鮮配制的卡諾固定液中, 室溫固定24小時(shí), 隨后放于–20°C冰箱, 可存儲(chǔ)數(shù)月。

(4)?? 用去離子水洗根2次, 每次5分鐘。

(5)?? 酶解。用解剖刀切下根尖(根尖端乳白色區(qū)域, 約2 mm), 浸沒于酶混合液中, 37°C水浴30–90分鐘(見注意事項(xiàng)7)。

(6)?? 用去離子水輕洗根尖2次, 每次1分鐘(酶解后根

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尖易碎, 動(dòng)作要輕)。

(7)?? 將根尖重新放入卡諾固定液中, 于–20°C冰箱中冷凍。同時(shí)將載玻片也放于–20°C冰箱中冷凍。

(8)?? 取1個(gè)根尖放于剛從–20°C冰箱中取出的載玻片上, 在其上滴加1滴預(yù)冷的卡諾固定液, 用解剖針搗碎, 在酒精燈火焰上迅速烤干, 即可用于FISH實(shí)驗(yàn)。

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4.7??????FISH實(shí)驗(yàn)

4.7.1?????涂片的預(yù)處理

(1)?? 將4.6.2節(jié)第(7)步所得染色體涂片浸沒于4%多聚甲醛固定液中, 室溫固定10分鐘。

(2)?? 將涂片取出, 分別在70%乙醇和無水乙醇中浸泡3分鐘。

(3)?? 豎直放置涂片, 室溫干燥。

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4.7.2?????染色體變性

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4.7.4???抗體反應(yīng)及探針檢測(cè)

(1)?? 將載玻片在2× SSC溶液中浸泡數(shù)分鐘, 直至蓋玻片脫落。

(2)?? 將載玻片豎直浸沒于2× SSC溶液中, 低速振蕩洗滌3次, 每次5分鐘。

(3)?? 配制抗體反應(yīng)液(避光操作)。取1個(gè)新的1.5 mL EP 管,? 向其中加入0.1%? PBST 溶液( 每張涂片加50 μL), 再向其中加入偶聯(lián)熒光素的抗地高辛或生物素的抗體(每張涂片加1 μL, 見注意事項(xiàng)11), 混勻后短暫離心。

(4)?? 將洗滌后的載玻片水平放于桌面上, 在載玻片未干時(shí)加入 50 μL 抗體反應(yīng)液 ,? 加蓋 1 張 24? mm? × 32 mm的Parafilm膜, 放入濕盒中, 于37°C溫箱中避光孵育30分鐘。

(5)?? 揭掉Parafilm膜, 用1× PBS低速振蕩洗滌載玻片3次, 每次5分鐘。

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(1)?? 在涂片上具有染色體的區(qū)域滴加100 μL 70%去離子甲酰胺, 加蓋1片24 mm × 32 mm的蓋玻片。

(2)?? 在95°C烘箱內(nèi)熱變性4分鐘(見注意事項(xiàng)8)。

(3)?? 取出涂片, 迅速甩去上面的蓋玻片, 插入–20°C

預(yù)冷的70%乙醇中, 低速振蕩浸泡5分鐘。

(4)?? 將涂片在–20°C預(yù)冷的無水乙醇中低速振蕩浸泡5分鐘。

(5)?? 將涂片豎直放置, 室溫干燥。

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4.7.3?????探針變性和雜交

(6) 將載玻片豎直放置, 室溫干燥后, 每張載玻片加10 μL 含抗褪色劑的DAPI 染液,? 蓋上1 片24 mm? × 32 mm的蓋玻片, 即可用于顯微觀察。成像結(jié)果參考圖2。

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2???????注意事項(xiàng)

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(1)?? 體外轉(zhuǎn)錄至少需要使用480 ng DNA, 較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是MYcroarray脫泡PCR后能夠回收2–4 μg DNA。

(1)?? 配制探針雜交液(按每張涂片加20 μL雜交液進(jìn)行配制)。取1個(gè)新的1.5 mL EP管, 向其中加入10 μL 100%去離子甲酰胺、2 μL 20× SSC、4 μL 50%硫酸葡聚糖(黏稠, 需緩慢吸取)、200 ng地高辛標(biāo)記的ssDNA探針和200 ng生物素標(biāo)記的ssDNA探針(見注意事項(xiàng)9), 用去離子水補(bǔ)足體積到20 μL, 混勻后短暫離心。

(2)?? 于沸水中熱變性5分鐘, 取出迅速置于冰水混合物中冷卻。

(3)?? 探針與染色體雜交。在每張變性好的染色體涂片上滴加20 μL探針雜交液, 加蓋1片24 mm × 32 mm的蓋玻片。

(4)?? 將載玻片放于濕盒上, 于95°C烘箱內(nèi)熱變性2分鐘(見注意事項(xiàng)10)。

(5)?? 取出濕盒和載玻片, 將載玻片放入濕盒中, 37°C

溫育8小時(shí)以上。

(2)?? 反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)至少需要42 μg RNA, 較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是回收的RNA產(chǎn)物總量大于80 μg。

(3)?? 應(yīng)盡量減少RNA的反復(fù)凍融, 若接著進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn), 可將RNA置于冰上。此外, 體外轉(zhuǎn)錄和RNA純化需要注意使用RNase-free 的耗材和試劑,? 謹(jǐn)防RNA降解。

(4)?? 較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是最終回收的ssDNA探針濃度大于150 ng·μL–1。

(5)?? 室溫固定時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)濃稠和探針信號(hào)弱, 固定時(shí)間太短又會(huì)導(dǎo)致染色體形態(tài)不佳或易破碎。一般用于FISH實(shí)驗(yàn)的水稻幼穗固定時(shí)間不超過3天, 室溫固定6–24小時(shí)效果較好。

(6)?? 野生型一朵穎花中的大部分花粉母細(xì)胞處于同一時(shí)期, 少量花粉母細(xì)胞處于臨近時(shí)期。例如, 一朵穎花中大部分花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的中期I, 可能含有少量細(xì)胞處于終變期和二分體時(shí)期。