1、PCR括增的基本原理

PCR (Polymerase Chain Reaction) 是體外高效復(fù)制DNA的技術(shù)，該技術(shù)幾乎貫穿于現(xiàn)在分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。PCR體系由模板，特異性引物，高溫聚合酶，脫氧核糖核酸幾部分組成。反應(yīng)過程分模板高溫變性（Denaturation），引物與模板低溫退火（Annealing）,引物在高溫聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的條件下，退火和延伸可以合二為一。

2、高溫聚合酶分類

高溫DNA聚合酶主要用于DNA片段的高溫快速擴(kuò)增（合成），它以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和Mg離子存在時(shí)，在特定的引物引導(dǎo)下按5’-3’的方向合成DNA。目前，用于高溫DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三類：第一類酶具有5’-3’方向的DNA合成（聚合）性能，沒有3’-5’方向的外切酶特性。

如Taq DNA聚合酶及其突變體。這類酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶強(qiáng)，因?yàn)樗荒芗m正合成過程中出現(xiàn)的突變。第二類和第一類酶類似，它有合成特性，沒有3’-5’方向的外切酶活性，即不具備保真性能。不同的是它們能以RNA為模板，合成DNA。也就是說它們具有逆轉(zhuǎn)錄功能。如Tth DNA聚合酶。

第三類酶具有第一類酶的DNA聚合特性，不擁有第二類酶的逆轉(zhuǎn)錄功能，但是它們具有3’-5’方向的外切酶活性。如Pfu DNA聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu能夠糾正DNA擴(kuò)增過程出現(xiàn)的錯(cuò)誤，如點(diǎn)突變。不足之處是該類酶的DNA延伸能力不及其它兩類。目前人們?cè)噲D用各種手段來提高第三類酶的延伸性能，它在現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中越來越收到重視。

3、如何選酶?

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)品的用途確定。第一類酶如Taq DNA聚合酶的主要用于檢測(cè)基因或特定DNA片段是否存在，制備DNA探針，T/A克隆時(shí)在DNA片段末端添加單個(gè)堿基，和Pfu一道用于較長(zhǎng)DNA片段的擴(kuò)增。這類DNA擴(kuò)增，DNA片段中可能存在的突變不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

第一類酶大多數(shù)使用場(chǎng)合，第二類酶都可以用。需要注意的是Tth的長(zhǎng)鏈PCR擴(kuò)增的能力不及Taq酶。人們更多注意的是Tth的逆轉(zhuǎn)錄功能，用它來實(shí)現(xiàn)基因單管單個(gè)酶的RT/PCR擴(kuò)增檢測(cè)。和傳統(tǒng)的AMV和MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶相比，Tth的RT是在高溫下進(jìn)行的，能有效的解除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是擴(kuò)增出的基因更為完整。

不足之處：Tth的RT能力不及AMV和MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶。第三類酶以Pfu DNA聚合酶為代表。Pfu是已知DNA聚合酶中，保真性最高的聚合酶。它擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物，隨機(jī)突變少，保證性能為Taq DNA聚合酶的10倍以上。Pfu主要用于克隆表達(dá)基因片段的合成，用于DNA突變實(shí)驗(yàn)。

如果要求擴(kuò)增DNA片段中的錯(cuò)誤特別少，減少下游分子操作不必要的回復(fù)突變工作。高保真DNA擴(kuò)增，使用Pfu DNA聚合酶是唯一的選擇。需要指出的是：用Pfu的DNA擴(kuò)增，突變少，但不是無突變無錯(cuò)誤擴(kuò)增。Pfu的不足之處是擴(kuò)增能力較差，2kb以上的基因擴(kuò)增需要優(yōu)化反應(yīng)條件。

將第一類或第二類與第三類酶按特定比例混合，能部分提高PCR擴(kuò)增的長(zhǎng)度和產(chǎn)物的保真性。我們提供的Taq Plus和SuperTaq屬于這類產(chǎn)品。這類產(chǎn)品的保真性一般為Taq酶的2倍左右。S公司聲稱Taq Plus的保真性達(dá)到Pfu的水平是沒有科學(xué)根據(jù)的,是極其不負(fù)責(zé)任的。

4、如何選擇酶的供應(yīng)商?

用可靠可信的酶。國(guó)外品牌公司的酶質(zhì)量是有保證的。理論上生產(chǎn)Taq的工藝不復(fù)雜，但是從非專業(yè)性生產(chǎn)商出來的產(chǎn)品往往不做嚴(yán)格的產(chǎn)品控制，他們的價(jià)格雖然低，但是給您研究帶來的潛在的威脅很大。很多公司沒有生產(chǎn)能力，為追求最高利潤(rùn)，經(jīng)常更換供應(yīng)商。

產(chǎn)品的穩(wěn)定性受到影響。一般情況下他們不做質(zhì)量控制。您買酶前最好問問他的酶是誰生產(chǎn)的，如果您僅僅被告知是國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口的，而不能告知明確的生產(chǎn)商，最好不要購(gòu)買。

5、遇到問題怎么辦?

影響DNA擴(kuò)增的因數(shù)很多，酶的質(zhì)量是個(gè)重要因素。 本公司提供的各類酶質(zhì)量都經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

使用本公司提供的各種DNA聚合酶一般可以排除產(chǎn)品本身的質(zhì)量問題。影響DNA擴(kuò)增效率的幾個(gè)重要因數(shù)：模板性質(zhì)和用量、Mg離子的濃度、退火溫度等。實(shí)際上 PCR擴(kuò)增沒有什么特殊的規(guī)律，做多了，您就成為專家了。如果您還不能得到滿意的答案，請(qǐng)直接向申能博彩咨詢。

6、如果您不能擴(kuò)增出產(chǎn)物，表明您使用的試劑或過程有問題嗎？

不一定。有些擴(kuò)增，您的引物，PCR擴(kuò)增使用的酶，dNTP可能都沒有問題，只是可能您沒有使用最合適的條件。有些基因表達(dá)量就是低，常規(guī)的PCR可能就沒有辦法擴(kuò)增出來。如果所有的基因都是那么容易擴(kuò)增出來，那有那么多形式的PCR技術(shù)如槽式PCR,Hot Start PCR, LA PCR。如果有時(shí)引物設(shè)計(jì)不合理，靠擴(kuò)增技術(shù)的改進(jìn)也不一定能彌補(bǔ)。