內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至90~100%

↓

PBS洗細(xì)胞3遍（室溫）

↓ 預(yù)熱的蛋氨酸和無(wú)血清的培養(yǎng)基（MEM）LL nL 50 μM（分子量，383.5，50 mM，25 mg 溶于二甲基硫氧化物DMSO中1304 μl） 在37℃下孵育2小時(shí)。

↓ 等同于（同步）MEM加1.5%BSA+10 μM LLnL50 μM 在37℃下孵育10分鐘。

↓

置于冰上，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞3次

↓ 37℃溫育2分鐘

↓ 放射性標(biāo)記：細(xì)胞在代謝中以100 μCi/ml［35S］蛋氨酸（14.7 μl）在1.5 ml 的無(wú)蛋氨酸MEM中標(biāo)記60分鐘。（25 mM D-glucose medium and Osmotic medium）LLnL50 μM

↓

制冷相被（10%FCS）0.5，1，3小時(shí)（25 mM D-glucose medium and Osmotic medium）

↓ 細(xì)胞提取物制備（0.5 ml 的溶解緩沖液，14000 rpm，離心16分鐘）

↓

樣品（0.5 ml）+酶抑制劑（50 μl）+苯甲磺酰氟（PMSF 1 M，1 μl）+1×NET 0.5 ml+抗體（抗HSPG 2 μg/mg 細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解物）

↓ 在4℃孵育3小時(shí)或過(guò)夜

↓

加50 μl 蛋白G瓊脂糖凝膠（5~10% in HBS），振蕩2~3小時(shí)

↓ 沉淀免疫復(fù)合物，混合物在室溫下6500 rpm離心1分鐘，用冰冷的1×NET洗沉淀物3次，棄去上清

↓

加50 μl 樣品緩沖液至沉淀物中，加熱100℃4分鐘，在冰上迅速冷卻，10000 rpm 離心1分鐘。

↓ 5%SDS-PAGE跑膠

（凝膠：①在固定液中30分鐘：25%甲醇和7.5%乙酸

②在水中30分鐘

③30分鐘autoflow

干膠，過(guò)夜）

PG turnover

同位素35S硫酸鹽50 μCi/ml

1. 細(xì)胞以50μCi/ml的35S硫酸鹽進(jìn)行放射性標(biāo)記20小時(shí)（過(guò)夜）

2. 移去培養(yǎng)基

3. 用PBS洗細(xì)胞3次

4. 加含1 mM Na2SO4培養(yǎng)基

5. 在不同的時(shí)間段孵化細(xì)胞（0，1，2，4，8，24小時(shí)）

在培養(yǎng)基和細(xì)胞中的總PGs

24孔板，3個(gè)孔有相同的濃度

1. 移去培養(yǎng)基：secreted PG（3ml）

2. 以胰蛋白酶抑制劑（0.025%）處理細(xì)胞，并在37℃孵育10分鐘（移去細(xì)胞表面結(jié)合的PG）

（1）每孔0.5 ml胰蛋白酶抑制劑（0.025%）

（2）移去（1），放入管中，以每孔0.5 ml PBS+BSA從孔中洗脫殘留細(xì)胞并放入管中?？偣? ml。

（3）1000 rpm離心10分鐘

（4）收集上清于管中測(cè)定細(xì)胞表面PGs

3. 步驟（3）后收集沉淀物

（1）以1 ml 4 M 鹽酸胍處理：細(xì)胞內(nèi)的PGs

乙醇沉淀PG測(cè)定

總PG

1. 能整除的PGs加3×體積的ETOH包含0.8 g Na醋酸鹽

2. 樣品用15 ml 管

（1）培養(yǎng)基樣品（2 ml）加6 ml EtOH

（2）胰蛋白酶抑制劑樣品（2 ml）加6 ml EtOH

（3）胍樣品（2 ml）加6 ml EtOH

3. 每個(gè)管加50 μl CS載體（1 mg/ml）

4. 在-20℃冰箱中孵育一夜

5. 2000 rmp離心1小時(shí)

6. 移去上清

7. 在0.5 N NaOH（1 ml）中溶解沉淀物

8. 移至小玻璃瓶中，加閃爍液并計(jì)數(shù)

軟骨素酶ABC處理后測(cè)定

試劑

（1）酶緩沖液：1 mM Tris，30 mM 醋酸鈉（Na acetate），10 mM EDTA，PH值8.0

（2）BSA 1 mg/ml

（3）n-ethyimalemicle（NEM）0.1 M

（4）胃蛋白酶抑制素（pepstatin 7.2 mM）和PMSF（0.1 mM）溶解于甲醇

（5）1小瓶軟骨素酶ABC （5單位）溶于0.5 ml 緩沖液中

方法

（1）透析剩余樣品（1mLt）（培養(yǎng)基，胰蛋白酶抑制劑和胍）入（into）酶緩沖液一夜

（2）每個(gè)透析樣品加液如下

（3）在37℃水浴中孵育過(guò)夜

（4）加ETOH（樣品的3倍體積）并在-20℃孵育18小時(shí)

（5）2000 rmp，4℃離心1小時(shí)，分離EtOH ppt

（6）在0.5 N NaOH（1 ml）中計(jì)數(shù)沉淀物HSPG