1、問：我用畢式酵母表達一個27KD的蛋白，小量表達并做SDS－PAGE有一條類似三聚體的條帶。用大量表達，表達上清用鎳柱進行親和層析，在FPLC上可以看到一個大峰，但跑電泳卻沒有發(fā)現(xiàn)條帶，為什么呢？請賜教

參考見解：你在大量表達后有沒有跑電泳檢測?表達上清用鎳柱親和層析后洗脫液有沒有電泳檢測?你首先要做的是:1,確定你的蛋白確實有表達;2,親和層析是表達的蛋白確實被洗脫下來了.然后再考慮FPLC的事.

在FPLC上可以看到一個大峰，但跑電泳卻沒有發(fā)現(xiàn)條帶，可能的原因有：

1，上樣時沒有目的蛋白，可能是1)沒表達2)親和層析時沒洗脫或是穿透了；

2，目的蛋白結(jié)合在FPLC柱子上沒被洗脫；

3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是鹽分峰；

4，電泳時沒跑好,目的蛋白沒被檢測到.

FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看與基線相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的話就是蛋白的濃度太低,濃縮后再跑電泳。

2、問：我現(xiàn)在做的是裂殖酵母表達，表達載體pesp-2,酵母菌珠sp-q01.說明只提供用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，但我轉(zhuǎn)化了好幾次都沒有結(jié)果，是否也可以用電轉(zhuǎn)化，在多克隆位點把質(zhì)粒線性化？

參考見解：其實無論是那種類型的酵母表達，轉(zhuǎn)化方法基本是一制的。

化學(xué)轉(zhuǎn)化法對酵母轉(zhuǎn)化講就不是很高，這里你可以用電轉(zhuǎn)的。查一下以前別人的討論，看看電轉(zhuǎn)化方法，效率提高了，篩選的希望就大些了

由于篩選表達酵母的時間比較長，兩個方案同時做應(yīng)該來的及的

至于線性化，對于電轉(zhuǎn)是要做的步驟，這是為了后面定位重組整合。

3、問：我做畢赤酵母分泌表達,想問做陰性對照的是應(yīng)該用加甲醇前的上清還是用一直不加甲醇搖瓶同樣時間的上清呢?

參考見解：對于陰性對照我一般都用轉(zhuǎn)了不含基因的原始質(zhì)粒（比如９K等）的菌作為對照，誘導(dǎo)過程中同樣加入甲醇，誘導(dǎo)的時間均一樣，每次樣品都會有一個對照。

陽性對照可以用以前表達的比較穩(wěn)定的蛋白的工程菌充當(dāng)。

4、問：請教各位高人：我用G418篩轉(zhuǎn)化有多拷貝的細胞株,篩了兩次,四個梯度0.5mg/ml,1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml.結(jié)果都沒長出細胞，空載體對照也沒長出。載體是pPIC9K。我用電轉(zhuǎn)，涂于MD固體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率較低，每塊板長出十幾個點，是否是轉(zhuǎn)化效率低導(dǎo)致的？謝謝指教！

參考見解：不知道你的轉(zhuǎn)化條件是否得到優(yōu)化？我認(rèn)為您是否可以從以下幾點入手：

（1）挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培養(yǎng)過夜；取100~500μl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達到1.3~1.5。

（2）電擊后馬上加入1ml冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體混勻。

（3）推薦：電壓1.5kV；電容25μF；電阻200Ω。電擊時間為4~10msec。