在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體(膜)上。膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。 有兩種規(guī)格：Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。

A 半干法

即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。

1 實驗條件的選擇

電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子 大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間，具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。

目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉(zhuǎn)移時間

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10 1.5

15--40 12 0.75

<20 15 0.5

2 實驗操作

(1)濾紙和膜的準(zhǔn)備 (在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作)。

A. 檢查是否有足夠的transfer buffer，沒有立即配制。

B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。

C. 將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transfer buffer中。

D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。

PDVF膜在進(jìn)轉(zhuǎn)移緩沖液時，要在甲醇里面泡多長時間?

PVDF是疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤。 PVDF的預(yù)處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉(zhuǎn)入蒸餾水洗兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。

一般5-20分鐘都有人在用。可在取膠的同時泡，估計前后5分鐘左右。效果還不錯。以前有站友發(fā)貼，說處理時間沒多大關(guān)系，關(guān)鍵看膜的質(zhì)量.確實是這樣的。只要讓膜完全浸透應(yīng)該就沒問題了。

Hybond的PVDF說明書這樣的寫的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，至少10秒鐘，多泡下也沒關(guān)系的，事實上，泡10秒的做過，10分鐘的也做過，都沒有問題的。

(2)轉(zhuǎn)移

A. 在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B. 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤。

C. 將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

D. 剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。

E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。

F. 裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時間。

G. 轉(zhuǎn)移過程中要隨時觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時調(diào)整。

3 注意事項及常遇到的問題：

1)濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。

2)濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

3)因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤(干膜法除外)。

4)濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙(靠膜)內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。

5)轉(zhuǎn)移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。

1)在疊膜、膠、紙三明治時候，操作于盛有轉(zhuǎn)膜Buffer的大平皿中進(jìn)行，疊好后，再將三者平行轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜裝置，切勿再移動，因為在buffer中操作，已經(jīng)完全排除了氣泡存在的可能，無需再趕氣泡

2)關(guān)于轉(zhuǎn)膜時間：半干轉(zhuǎn)的話，20 V×30min即可

B 濕法

我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。

C 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定

1.染膠

用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效果。

2.染膜

有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析