一、材料和方法1．試劑及耗材

蛋白抽提試劑（改進型RIPA配方）

BCA蛋白定量試劑盒

5×還原樣品緩沖液

10×Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液

考馬斯亮藍染色液

10×TBST pH8.0

濕轉(zhuǎn)緩沖液

PVDF膜，0.22um孔徑

麗春紅染色液

PMSF

蛋白酶抑制劑

封閉液

ECL發(fā)光液

山羊抗兔IgG（H+L），HRP

兔抗山羊IgG（H+L），HRP

β-actin 鼠單抗

2．實驗儀器

Fresco低溫冷凍離心機

MultiSkan3酶標(biāo)儀

電泳槽

濕轉(zhuǎn)電泳槽

電泳儀

水平脫色搖床 二、 實驗方法及結(jié)果3.1細胞蛋白抽提

預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑（德元Cat# LY7001），加入蛋白酶抑制劑（德元Cat# LY7150）。在蛋白抽提開始前加入0.1M PMSF母液，PMSF終濃度1mM。細胞計數(shù)，以細胞數(shù)量1×107加入1ml裂解液，用槍頭吹打充分懸起細胞，完成后在冰上孵育20min，4度離心，13000rpm，20min。離心完成后取上清，分裝保存，待測。

3.2 BCA法蛋白定量

準(zhǔn)備BCA（德元Cat# LY7052）工作液 A液：B液=50:1，稀釋好各個濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)品,樣品用PBS進行稀釋。

每孔加樣品200ul,標(biāo)準(zhǔn)品也加200ul,再加25ul,混勻后37度孵育30min或者室溫孵育60min，酶標(biāo)儀570nm波長濾光片讀取OD值。用Ascent軟件分析濃度值。

3.4 SDS-PAGE

3.4.1 根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%。

3.4.2 待檢測蛋白樣品上樣量：上樣15ug

3.4.3 電泳條件：濃縮膠恒壓90V，約20min，溴酚藍進行分離膠界面；分離膠恒壓160V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。

3.5轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法）

轉(zhuǎn)膜條件：300mA恒流；0.22um孔徑PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時間75min。轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。同時做好泳道標(biāo)記，準(zhǔn)備預(yù)實驗時進行按照縱向泳道剪膜。

3.6 封閉：將膜完全浸沒封閉液（德元國際 Cat# LY7141）中室溫輕搖60min。

3.7 一抗孵育：用TBST稀釋一抗，室溫孵育10min，放4℃過夜。

3.8 洗膜

第二天從4度拿出膜，在室溫孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次10min。

3.9 二抗孵育：

用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L） HRP 山羊抗小鼠IgG（H+L） HRP兔抗山羊IgG（H+L） HRP，1:5000，室溫輕搖 40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3min。

3.10 ECL（德元國際Cat# LY7123）加到膜上后反應(yīng)2min，膠片曝光：10s-5min（曝光時間隨不同光強度而調(diào)整），顯影2min，定影。晾片，掃描等后續(xù)分析。