在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染膜。只是后來(lái)發(fā)現(xiàn)此操作不僅增加額外的操作時(shí)間，而且不能說(shuō)明任何問(wèn)題，于是拋棄之。首先，立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠(yuǎn)，即使立春紅染膜無(wú)顏色，也無(wú)法提示W(wǎng)B結(jié)果會(huì)不會(huì)失?。既灸z無(wú)顏色也不能說(shuō)明轉(zhuǎn)膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無(wú)法提示靶蛋白就轉(zhuǎn)膜完全了，也許只是另外一個(gè)分子量大小相近的蛋白。

因此，無(wú)論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進(jìn)行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時(shí)間，而且增加一輪漂洗的操作，對(duì)膜和膜上的蛋白都不好。

那么為什么不采用更直觀的預(yù)染marker做轉(zhuǎn)膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時(shí)轉(zhuǎn)膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，非常直觀、不會(huì)增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）。當(dāng)然上面提到針對(duì)PVDF膜，由于對(duì)小分子截留的局限，顏料分子會(huì)在高強(qiáng)度的轉(zhuǎn)印過(guò)程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過(guò)膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過(guò)深會(huì)使整個(gè)lane糊掉；太緊（多）可改變蛋白構(gòu)象使遷移率改變。

所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)，這意味著在某些條件下，顏料會(huì)從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因?yàn)槟し肿涌讖揭约澳?duì)不同物質(zhì)吸附能力的差異，顏料小分子會(huì)輕易穿過(guò)膜到濾紙背面，而蛋白則被牢固的截留在膜上），造成轉(zhuǎn)膜過(guò)度的假象。

現(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換NC膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉(zhuǎn)膜條件、注意必要的細(xì)節(jié)，就可從根本上忽略掉其對(duì)轉(zhuǎn)膜效率的指示，而把預(yù)染的marker僅僅作為一個(gè)分子量大小的指針，當(dāng)然同時(shí)可確認(rèn)之前的轉(zhuǎn)膜操作無(wú)誤（沒(méi)有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時(shí)膜的正反面做必要的提示。

不同公司預(yù)染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常規(guī)分子量預(yù)染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（膠大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul轉(zhuǎn)膜后就足夠清晰。