【知識(shí)分享】常溫下的液相色譜：液相色譜方法何時(shí)應(yīng)該設(shè)置準(zhǔn)確的溫度？

納譜分析

2023.2.01

在反相色譜中，提高柱溫通常會(huì)降低分析物的保留。在一個(gè)沒(méi)有控制柱溫的方法中，如果實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度發(fā)生了變化，會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題？

在早期的液相色譜中，精準(zhǔn)控制色譜柱溫度并不是許多儀器設(shè)置中的首要考慮因素。不像氣相色譜，柱溫是決定保留的最重要的實(shí)驗(yàn)變量，在液相色譜中，柱溫對(duì)于保留的影響相對(duì)流動(dòng)相的組成來(lái)說(shuō)要弱很多（也就是說(shuō)，反相、親水色譜HILIC中有機(jī)相和水相的比例，或基于電荷分離方法中陰離子和陽(yáng)離子濃度的比例對(duì)于分析物保留的影響重要的多）。

隨著大家對(duì)液相色譜中溫度影響的認(rèn)識(shí)在不斷提高，例如，進(jìn)一步了解了柱溫對(duì)于不同類(lèi)型分析物保留的影響（1），色譜柱入口處流動(dòng)相溫度與色譜柱溫度匹配的重要性（2），以及色譜柱中熱流對(duì)柱效的影響（3），精準(zhǔn)控制液相色譜柱溫度的需求也在不斷的增加。越來(lái)越多的色譜工作者已經(jīng)開(kāi)始注意控制液相色譜儀的溫度（儀器廠家也早已設(shè)計(jì)出了相應(yīng)的儀器模塊），并且在開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證方法的時(shí)候習(xí)慣明確規(guī)定一個(gè)溫度值或者溫度范圍。然而，現(xiàn)在還是有很多在用的方法上標(biāo)明的是“室溫”條件，而且大多時(shí)候方法中所指的“室溫”并沒(méi)有一個(gè)明確的定義。這樣就產(chǎn)生了一個(gè)很明顯的問(wèn)題：類(lèi)似這樣的方法，我們能否合理預(yù)期在阿拉斯加的安克雷奇和在印度的孟買(mǎi)能得到相同的分離效果？

在這期“液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題處理”中，我們將會(huì)討論液相色譜中溫度對(duì)化合物保留的影響的原理，并且以一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)幫助我們理解如果允許“室溫”條件發(fā)生一些變化，將在什么情況下會(huì)嚴(yán)重影響化合物的分離。

反相液相色譜中柱溫對(duì)于化合物保留影響的原理

在反相液相色譜中，柱溫對(duì)化合物保留的影響通?？梢酝ㄟ^(guò)Van’t Hoff定律來(lái)進(jìn)行描述，如下所列的方程1：

k是分析物的保留因子，T是在這個(gè)k值下的溫度。變量A是一個(gè)特定條件下參數(shù)，與分析物從流動(dòng)相到固定相之間熵的傳遞和相比（固定相體積和流動(dòng)相體積的關(guān)系）有關(guān)，變量B則與分析物從流動(dòng)相到固定相之間焓的傳遞有關(guān)。圖1顯示了在C18色譜柱，乙腈水為流動(dòng)相的條件下，幾個(gè)中性小分子化合物在不同的溫度下的保留數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)大致呈線性變化的趨勢(shì)，如方程1所預(yù)測(cè)的一致。Weber團(tuán)隊(duì)通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，得出結(jié)論是方程式1的非線性版本比線性版本能更好的貼合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（1）。還有其他研究人員則提出了爭(zhēng)議，認(rèn)為數(shù)據(jù)呈現(xiàn)線性的表象更趨向于是一種巧合，而不是熱力學(xué)的必然性。

圖1.?幾個(gè)中性小分子化合物在C18色譜柱，乙腈水（50/50）作為流動(dòng)相的條件下，柱溫（T）的變化對(duì)保留因子（k）的影響：（a）為甲苯，乙苯和丙苯；（b）為對(duì)硝基氯芐和苯甲醚。虛線為線性回歸線。數(shù)據(jù)來(lái)源于Yun Mao的博士學(xué)位論文（6）。

圖1中各直線的斜率與分析物從流動(dòng)相到固定相之間焓的傳遞有關(guān)。對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的分子而言，這些斜率的數(shù)值相似，如圖1a中的甲苯，乙苯和丙苯所示數(shù)據(jù)。對(duì)于這些結(jié)構(gòu)類(lèi)似化合物的分離，提高柱溫能夠減少分析物的保留，而不會(huì)對(duì)各峰之間的間距（也就是說(shuō)選擇性）產(chǎn)生太大的變化，因?yàn)樗械姆宥际且圆畈欢嘞嗤乃俾食粋€(gè)方向移動(dòng)。然而，對(duì)于一些帶有不同官能團(tuán)的化合物，斜率則會(huì)差異很大，如圖1b中的對(duì)硝基氯芐和苯甲醚。在這類(lèi)實(shí)例中，提高柱溫會(huì)減少分析物的保留，但由于變化速率不同，因此選擇性和分離度將會(huì)發(fā)生變化。極端的例子表明甚至還能導(dǎo)致洗脫順序發(fā)生變化（5）。大家若有興趣，可以簡(jiǎn)單通過(guò)下面網(wǎng)站提供的模擬裝置進(jìn)行嘗試，在上面可以通過(guò)改變流動(dòng)相組成和色譜柱溫度，然后觀察對(duì)保留和分離的影響(www.multidlc.org/hplcsim)。

讓我們來(lái)看看一些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)

在準(zhǔn)備寫(xiě)這期“液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題處理”的時(shí)候，我給我們實(shí)驗(yàn)室的一臺(tái)液相色譜儀制造了一個(gè)微環(huán)境。首先斷開(kāi)色譜柱常用的柱溫箱，然后對(duì)微環(huán)境進(jìn)行加溫或者降溫，來(lái)模擬“室溫”的變化對(duì)于分離的影響，并且利用一個(gè)小熱電偶來(lái)測(cè)量色譜柱入口處附近環(huán)境的溫度。最后，我記錄了幾款簡(jiǎn)單化合物（一個(gè)酸性，一個(gè)堿性，兩個(gè)中性化合物）在不同“室溫”條件下的色譜圖，每個(gè)溫度下系統(tǒng)都平衡了30分鐘。圖2為24、28和42 ℃三個(gè)“室溫”條件下的色譜圖。添加垂直虛線作為視覺(jué)輔助，有助于觀察隨著溫度的升高保留的變化。

圖2：測(cè)試物在不同溫度下的色譜圖。添加垂直虛線作為視覺(jué)輔助，助于對(duì)比保留時(shí)間。

條件：色譜柱50 mm x 4.6-mm i.d., Zorbax SB-C18 (5-μm)；流速1.0 ml/min；流動(dòng)相，乙腈：甲酸銨水溶液（25mM銨鹽/氨水，105mM甲酸/甲酸鹽，pH3.2）40:60（v/v），進(jìn)樣量2 μL。測(cè)試化合物1）苯乙酮，2）去甲替林，3）苯丁酮，4）丁基苯甲酸

盡管這些變化肉眼可見(jiàn)，然而根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果繪制出與溫度的函數(shù)關(guān)系能更準(zhǔn)確的了解這種影響，尤其是選擇性的變化。圖3清晰的表明了溫度對(duì)這四種目標(biāo)化合物保留的影響。在圖3a中，我繪制出了各溫度下保留因子的絕對(duì)值，在圖3b中，則繪制出了在測(cè)量溫度范圍內(nèi)的每種化合物保留因子與平均保留因子比值的百分比變化。果不其然，所有化合物的保留都隨著溫度的升高而減少，這是我們通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)得出的第一個(gè)要點(diǎn)?！笆覝亍钡淖兓隙芤鹦》肿踊衔锏谋Ａ舭l(fā)生大約2%的變化。在42 ℃下的數(shù)據(jù)誠(chéng)然有點(diǎn)極端，甚至超出了美國(guó)實(shí)驗(yàn)室室溫條件下的適用范圍，但是對(duì)于全球的液相色譜實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)是有必要的。

在圖3b中，我們發(fā)現(xiàn)除了去甲替林曲線斜率更陡之外，其他曲線斜率的變化趨勢(shì)（k值變化的百分比與溫度T）基本一致。就像先前討論過(guò)的，如果所有化合物的保留隨著溫度變化以相同的速率發(fā)生同樣的變化，這種情況下，溫度的設(shè)置對(duì)于方法的執(zhí)行不會(huì)產(chǎn)生太大的問(wèn)題，因?yàn)椴粫?huì)對(duì)分離度有什么影響。然而，圖3b中去甲替林保留變化的速率高出了其他化合物大約兩倍。

圖3：待測(cè)化合物在測(cè)試溫度范圍內(nèi)（21-42 ℃）保留因子(a)和保留因子百分比(b)的變化

通過(guò)繪制出選擇因子與溫度的變化曲線，我們能更準(zhǔn)確的看到相對(duì)保留上的這些變化。圖4a為不同溫度下幾對(duì)目標(biāo)化合物的選擇因子α值，圖4b為選擇因子α值變化百分比隨溫度的變化關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度從24 ℃升高到42 ℃，中性化合物（苯乙酮和苯丁酮）的選擇性沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。甚至苯丁酮和丁基苯甲酸的選擇性也沒(méi)有發(fā)生明顯變化，盡管他們的化學(xué)性質(zhì)截然不同。即使丁基苯甲酸可電離，但在pH3.2條件下絕大多數(shù)還是呈中性狀態(tài)。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在所研究的溫度范圍內(nèi)，去甲替林的選擇因子的變化非常大。去甲替林與苯丁酮（紅圈）或丁基苯甲酸（藍(lán)圈）的α選擇因子比值變化接近5%。

圖4：待測(cè)化合物在測(cè)試室溫范圍內(nèi)（21-42 ℃）選擇因子(a)和選擇因子百分比(b)的變化

對(duì)方法開(kāi)發(fā)和執(zhí)行可能造成的影響

到目前為止，我們觀察到溫度的變化可能對(duì)一些，但不是全部，類(lèi)型的化合物在反相色譜分離上的選擇性產(chǎn)生明顯的影響。在實(shí)際應(yīng)用中很重要的問(wèn)題是：在什么情況下這些變化會(huì)變得很重要？我所研究的幾個(gè)化合物分離的很好（圖2），即使5%選擇性的變化也不會(huì)導(dǎo)致它們達(dá)不到基線分離。然而，實(shí)際應(yīng)用中碰到的情況并不都是這樣。例如，在一個(gè)室溫條件下勉強(qiáng)達(dá)到分離的兩個(gè)相鄰的峰，當(dāng)換到另外一個(gè)室溫條件時(shí)，則可能會(huì)對(duì)這兩個(gè)峰的分離造成很大影響。我們可以通過(guò)Purnell方程（方程2）來(lái)定量這種影響。

我們假設(shè)柱效（N）為15000，兩個(gè)峰其中后出峰的保留因子（k）為5，選擇因子α為1.1，則兩個(gè)峰之間的分離度（Rs）則大約為2.3。我們可以通過(guò)方程2計(jì)算出選擇因子的變化對(duì)分離的影響。圖5中顯示了當(dāng)α值減少5%時(shí)（從1.1降低至1.045），分離度是如何降低的。分離度2.3意味著兩個(gè)峰分離度良好，達(dá)到了基線分離，然而分離度1.1則意味著兩個(gè)峰之間有部分重疊。重疊的峰則會(huì)嚴(yán)重影響方法的準(zhǔn)確定量，尤其是當(dāng)兩個(gè)物質(zhì)中一個(gè)物質(zhì)的濃度遠(yuǎn)高于另外一個(gè)的時(shí)候。

圖5：選擇性α的降低對(duì)兩個(gè)相鄰峰的分離度的影響。分離度通過(guò)Purnell方程（方程2）計(jì)算得出，假設(shè)N=15000，k=5，初始α=1.1

結(jié)論：

在這期“液相色譜常見(jiàn)問(wèn)題處理”中，我們驗(yàn)證了在沒(méi)控制柱溫的情況下，室溫的變化對(duì)于反相液相色譜分析性能的影響。在絕大多數(shù)的實(shí)例中顯示，增加溫度會(huì)導(dǎo)致反相色譜保留減弱。只要溫度的變化對(duì)相鄰兩個(gè)峰保留變化的影響都差不多，則不會(huì)對(duì)這兩個(gè)峰的分離有什么影響。然而，這并不能代表所有的情況，有時(shí)分離的選擇性發(fā)生大約百分之幾的明顯變化。而這些選擇性的變化會(huì)反過(guò)來(lái)導(dǎo)致相鄰峰之間分離度發(fā)生明顯的減少（或增加），而這些分離度的變化大約能達(dá)到50%！

總的來(lái)說(shuō)，這意味著：

在方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程中明確規(guī)定“室溫”的條件，將有利于避免在方法執(zhí)行的過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題，尤其是該方法需要到各個(gè)不同環(huán)境的實(shí)驗(yàn)室去得到執(zhí)行，而這些實(shí)驗(yàn)室所處的室溫環(huán)境各不相同。

在方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，柱溫變化對(duì)方法影響的敏感程度，需要被列入方法穩(wěn)定性的考察之中。

用恒溫箱來(lái)控制色譜柱的柱溫能夠避免上述所有問(wèn)題的發(fā)生，盡管是以增加了一個(gè)儀器模塊作為代價(jià)。

May 01, 2020

By?Dwight R. Stoll

LCGC North America?Volume 38, Issue 5, pg 261–268

參考文獻(xiàn)

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