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Nature Protocol：i-GONAD技術簡介 CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀原位遞送RNPs至受精卵制備CRISPR基因編輯工程小鼠
Nature Protocol：i-GONAD技術簡介
CUY21EDIT Ⅱ電轉(zhuǎn)儀原位遞送RNPs至受精卵制備CRISPR基因編輯工程小鼠
??????? 創(chuàng)建基因工程小鼠的傳統(tǒng)方法包括三個主要步驟：1.?從一組雌性動物中收獲胚胎，2.?將試劑微注射到離體胚胎中，3.?然后通過外科手術將其轉(zhuǎn)移到另一組雌性動物中，盡管繁瑣，但這些方法已經(jīng)使用了三十多年。研究者最近開發(fā)了一種名為GONAD的方法（genome editing via oviductal nucleic acids delivery），該方法繞開了這些步驟。GONAD技術將將CRISPR成分（Cas9 mRNA和guide RNA（gRNA））注入孕后1.5d孕鼠的輸卵管，通過CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀，在體內(nèi)電穿孔將這些核酸組分原位遞送到受精卵中，使用GONAD證明了靶基因可以在小鼠胚胎發(fā)育的不同階段被破壞和分析。
??????? 現(xiàn)在，研究者開發(fā)了改良版GONAD（i-GONAD）。 通過CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀導入CRISPR RNPs（RNPs：?Cas9蛋白/Cpf1蛋白?+ gRNA）進入第0.7天孕鼠體內(nèi)，使其適合常規(guī)基因?qū)?，提供單鏈DNA（ssDNA）修復模板后，i-GONAD還可以生成包含多達1kb插入片段的敲入模型，基因編輯效率更高。i-GONAD還具有其他優(yōu)勢：不需要切除輸卵管或子宮，使用i-GONAD的雌鼠不會被處死，還可以用于其他實驗，掌握小動物手術的研究人員在沒有精密顯微注射設備的實驗室中就能輕松進行，高效同時也節(jié)省成本。
??????? 這個protocol提供了建立GONAD方法的分步方案，該方案需要約6周的時間來生成G0代基因工程小鼠。
??????? 整個i-GONAD技術的流程中不需要精密的顯微注射步驟，需要的儀器僅為體式顯微鏡（Olympus, model no. SZ11)）和CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀，以及一些常用的手術器械。
??????? 關鍵的電轉(zhuǎn)步驟如圖所示
??????? 上圖顯示體內(nèi)電轉(zhuǎn)的示意圖（步驟22–26）。a.?用一塊濕的Kimwipe毛巾覆蓋輸卵管。b.?將電極浸入滅菌PBS中。c.將電極放置在被Kimwipe覆蓋的輸卵管上，以抓住組織，使用CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)（ 左）和輸卵管的電轉(zhuǎn)（右）。d.?最好用蘸有70％（vol/vol）乙醇的棉布擦拭電極的內(nèi)表面，以清潔后再用于輸卵管。
??????? 在不同的實驗條件下，對8至10周齡的C57BL / 6J雌性小鼠進行實驗，使用CUY21Edit II電轉(zhuǎn)儀進行100 mA電轉(zhuǎn)的i-GONAD，實驗觀察到100 mA電流在C57BL / 6小鼠品系中產(chǎn)生最一致和最佳的結(jié)果，在這種電穿孔條件下，在Tyr?locus中獲得了96％的indel突變效率。 電流200mA以上的時候基因編輯效率高達100%，但是小鼠胚胎數(shù)量會變少，因此作者推薦大部分小鼠品系選擇電流的時候選擇50-200mA區(qū)間范圍（50mA，100mA，150mA，200mA）。
??????? Nature Protocol中電轉(zhuǎn)條件為CUY21Edit II: square (mA), (+/?), Pd V (voltage of the pulses): 60 V or 80 V, Pd A (current of the pulses): 100–150 mA, Pd on: 5.00 ms, Pd off: 50 ms, Pd N (pulse cycle): 3, decay: 10%, decaytype: Log
??????? GONAD后植入前小鼠胚胎中的熒光。（a）-（c）從MCH（ICR）雌性收集的兩細胞胚胎，在注射溶液后進行i-GONAD實驗流程，含有四甲基羅丹明標記的葡聚糖3kDa（紅色），EGFP mRNA（綠色），注意觀察到的胚胎既有紅色也有綠色，（d）至（f）為從MCH（ICR）雌性收集的兩細胞胚胎經(jīng)過類似處理的對照組實驗結(jié)果 ?？梢杂^察到CUY21Edit II電轉(zhuǎn)效率非常高。
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CUY21EDITⅡ電轉(zhuǎn)儀：
?通過該儀器實現(xiàn)了精確的矩形波和雙脈沖衰減脈沖波輸出
?可以用于體內(nèi)和體外實驗的真正的電基因轉(zhuǎn)移裝置
?業(yè)界第一款恒流脈沖輸出
?恒定電流脈沖非常適合諸如GONAD之類的體內(nèi)電轉(zhuǎn)
?出色的觸摸屏操作性
?記錄所有輸出脈沖的執(zhí)行電壓和電流值
?輸出脈沖記錄可以導出到USB存儲器
??????? 在電轉(zhuǎn)實驗中，電穿孔造成細胞損壞程度主要取決于電流大小，電流值決定電穿孔的成敗。
??????? 示例）在鑷子型電極之間夾有樣品（卵形管）時即使電壓相同，根據(jù)電極之間的距離和電極的狀態(tài)（氧化等），流過的電流也不同。
??????? CUY21 EDIT II能夠?qū)崟r檢測電阻，控制電壓，產(chǎn)生恒流的電流脈沖輸出。換句話說，將輸卵管夾在鑷子型電極之間的GONAD實驗中，即使各實驗之間的夾持力不同，電流依然保持恒定值。在多種具有許多參數(shù)變量的體內(nèi)電穿孔，可以保持電參數(shù)固定，帶給您更好的實驗重復性和更高的基因?qū)?編輯效率。
??????? CUY21 EDIT II電轉(zhuǎn)儀滿足所有活體電轉(zhuǎn)，原代細胞（如原代神經(jīng)元），貼壁細胞，難轉(zhuǎn)染細胞等的高效基因轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)過程無需特殊溶液，為您節(jié)省成本，減少操作，提升效率。
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文獻來源：
Nat Protoc. 2019 Aug;14(8):2452-2482. doi: 10.1038/s41596-019-0187-x.
