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2025.4.07

構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株是生物制藥領(lǐng)域CMC流程中的核心步驟，通過(guò)精心策劃的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出高效且穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞株，從而為后續(xù)的生物制品的產(chǎn)量和質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

在構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株過(guò)程中，以下的關(guān)鍵環(huán)節(jié)需嚴(yán)格遵循以確保高效與穩(wěn)定：

1.載體策略與設(shè)計(jì)：在載體設(shè)計(jì)階段，需精心選擇啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件，以精確控制目的基因的表達(dá)水平。

2. 轉(zhuǎn)染方法與優(yōu)化：根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞類型及實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的轉(zhuǎn)染方法，如電轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)等。

3.高通量篩選與克隆鑒定：利用高通量篩選技術(shù)和先進(jìn)的檢測(cè)方法，如單細(xì)胞打印機(jī)，對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行快速篩選，挑選出表達(dá)水平高且穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。

4.表達(dá)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)：在細(xì)胞株構(gòu)建完成后，需定期檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)情況，包括表達(dá)水平、時(shí)空分布等。通過(guò)長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)，確保細(xì)胞株的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性，以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用的需求。

單克隆篩選是細(xì)胞系開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵步驟，旨在從混合細(xì)胞群體中分離出單個(gè)細(xì)胞，并使其增殖形成遺傳背景均一的細(xì)胞克隆。以下是一些常見(jiàn)的單克隆篩選方法：有限稀釋法，半固體培養(yǎng)基挑選法，以及流式細(xì)胞術(shù)挑選法等。

有限稀釋法和流式熒光激活細(xì)胞分選（FACS）很常見(jiàn)，但在效率、選擇控制和細(xì)胞活力等方面都不理想。有限稀釋法雖然經(jīng)濟(jì)，可能比FACS分選對(duì)細(xì)胞造成損傷小，但耗時(shí)耗力，可能還會(huì)有些人為因素的影響。

流式分選雖然對(duì)單細(xì)胞有良好控制且通量高，但分選時(shí)產(chǎn)生的高剪切力和持續(xù)靜電，會(huì)對(duì)敏感或部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)）的存活率/克隆效率有很大不良影響。

單細(xì)胞打印技術(shù)它以一種非常溫和、低成本和高度可控技術(shù)，適合從0-40μm的各種特異性細(xì)胞克隆應(yīng)用。通過(guò)專利的噴墨式打印技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞非接觸式的分離到標(biāo)準(zhǔn)的96/384孔板中，實(shí)現(xiàn)高通量工作流程。特別適用于工程細(xì)胞的克隆，在維持細(xì)胞原有生命活力的同時(shí)，還為單細(xì)胞克隆性提供了直接的證據(jù)（提供每個(gè)打印細(xì)胞的可靠記錄），可根據(jù)細(xì)胞直徑、圓度和熒光強(qiáng)度進(jìn)行分選，并且可以整合到其它單細(xì)胞分析管路上，與各種下游流程的兼容性。

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2，廣泛應(yīng)用于通過(guò)RNAi、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a進(jìn)行的基因敲除研究、以及iPS誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、CAR-T的研究中，在包括功能和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)以及基因和細(xì)胞療法的研究中大放異彩。

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