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Nature ?？?？一文弄懂 LNP，內(nèi)附制備 Protocol | MCE
脂質(zhì)納米顆粒，做藥物遞送的小伙伴一定不陌生！遙想當年，小 M 也是看著同門拿著儀器擠膜，做表征，來來回回……本期就給大家整理下關(guān)于脂質(zhì)納米顆粒那些事兒~
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01
脂質(zhì)納米顆粒
?LIPID NANOPARTICLES
脂質(zhì)納米顆粒?(Lipid Nanoparticle，LNP)?是一種脂質(zhì)類物質(zhì)組成的納米粒子，具有均勻脂質(zhì)核心，廣泛用于小分子和核酸藥物的遞送 (詳見往期：藥物如何遞送 ？脂質(zhì)納米顆粒！)。
圖 1. 脂質(zhì)納米顆?；窘M成[1]。
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脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)的優(yōu)勢：
? 低免疫原性、具有良好的生物相容性和安全性
? 穩(wěn)定性強，在體內(nèi)不易變形
? 核酸包封率高
? 細胞穿透性強、轉(zhuǎn)染效率高
? 內(nèi)體逃逸能力強
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02
?如何制備？
? HOW TO PREPARE?
脂質(zhì)納米顆粒?(LNP)?的制備依賴于自組裝的能力，帶負電荷的核酸和帶正電荷的脂質(zhì)之間產(chǎn)生靜電絡(luò)合，LNP 通過脂質(zhì)組分之間的疏水作用和范德華作用相互生長。
LNP 的制備可以通過多種方式進行，例如脂質(zhì)囊泡的擠出、脂質(zhì)膜的再水化、納米沉淀、微流體混合，一般的制備方式是將水和脂質(zhì)成分快速混合。小 M 為大家整理了高分文獻中常用的制備方案，大家可以根據(jù)自己的實驗目的進行脂質(zhì)搭配比例上的調(diào)整~
? 天平稱取 15 mg DLin-MC3-DMA?(MC3)，然后加入 200 μL 純乙醇溶解 MC3，使其濃度達到 75 mg/mL;
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mRNA 包載物
mRNA 應溶解在 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液?(10 mM，pH 4)?中，將上述步驟中得到的脂質(zhì)混合溶液與含有 mRNA 的水性緩沖液快速混合以實現(xiàn) 40/1?(總脂質(zhì)/mRNA，wt/wt)?的最終重量比。
注：mRNA 比例可以增加以降低潛在的脂質(zhì)毒性
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mRNA –LNP 的制備
有三種常用的方法可以實現(xiàn)混合脂質(zhì)溶液和 mRNA 溶液的快速混合：移液管混合法?(小規(guī)模制備)、渦旋混合法?(中等規(guī)模制備)?和微流體混合法?(大規(guī)模制備) 。
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1. 將 16.8 μL 上面得到的混合溶液 I 加入不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中；
2. 向試管中加入 1.2 μL 乙醇，充分混勻得到混合溶液 II；
3. 取另一個不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管，加入 46 μL 檸檬酸緩沖液?(10 mM，pH 4)，向試管中加入 8 μL mRNA?(1.0 mg/mL)，混合均勻;
4. 取 54 μL mRNA 緩沖液 加入步驟 2 中獲得的混合溶液 II，立刻吹打混勻 20-30s?(手動混勻);
注：水：乙醇的體積比為 3:1，混合后立即吹打混勻。否則可能影響 mRNA-LNP 混合物的活性。
5. 將步驟 4 得到的溶液在室溫下孵育 15 min；
6. 使用透析管?(MWCO 3500)?在 1 x PBS 中透析上述溶液 1 h 以上，以除去乙醇和酸性緩沖液；
7. 透析后，將溶液轉(zhuǎn)至不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中，測量體積;
8. 加入 1 x PBS 溶液，使總體積達到 800 μL。
注：這步得到的溶液可以在 4℃ 短期保存。?
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1. 將 21 μL 上面得到的混合溶液 I 加入不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中；
2. 向試管中加入 9 μL 乙醇，充分混勻得到混合溶液 II；
3. 取另一個不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管，加入 80 μL 檸檬酸鹽緩沖液?(10 mM，pH 4)，向試管中加入10 μL mRNA?(1.0 mg/mL)，混合均勻;
4. 將渦旋混合器設(shè)備設(shè)置為“ON”，速度水平設(shè)置為“1”;
5. 在渦旋混合器上以中速渦旋 mRNA 緩沖液，再移取 30 μL 混合溶液 II 快速加入渦旋溶液中，將所得混合溶液渦旋 20-30 S;
注：水：乙醇的體積比為 3:1，混合后立即吹打混勻。否則可能影響 mRNA-LNP 混合物的活
6. 將步驟 5 所得溶液在室溫下孵育 15 min;
7. 使用透析管（MWCO 3500)?在 1 x PBS 中透析上述溶液 1 h 以上，以除去乙醇和酸性緩沖液;
8. 透析后，將溶液轉(zhuǎn)至不含 RNA 酶的 1.5 mL 試管中，測量體積;
9. 加入 1 x PBS 溶液，使總體積達到 1000 μL。
注：這步得到的溶液可以在 4℃ 短期保存。
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具體操作方案使用儀器相關(guān)度很高，建議參考具體使用的儀器官網(wǎng)步驟進行。
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03
?LNP 的表征
? Characterization of LNPs
為了確保 LNP 的質(zhì)量和有效性，需要對 LNP 進行參數(shù)表征，例如尺寸、PDI、電荷、RNA EE。
??Zeta?(平均直徑/粒徑): 通過動態(tài)光散射?(DLS)?檢測。
??PDI?(Polydispersity index,?多分散指數(shù))?：范圍 0-1，數(shù)值越高表示多分散性越強，數(shù)值越小表示粒度越均勻，通過動態(tài)光散射?(DLS)?檢測。
??Charge?(電荷)：對于基于 RNA 的 LNP，通常優(yōu)選近中性電荷，通過 ζ 電位分析儀測量。
??Morphology?(形態(tài))：通過電子顯微鏡?(TEM、Cyro-EM、SEM、AFM 等)?檢測。
??RNA EE?(RNA Encapsulation Efficieney%,?RNA 包封效率)?：可通過 Ribogreen 測定來測量，先測定 LNP 外的 RNA 濃度，然后使用表面活性劑溶解 LNP 來測量 LNP 內(nèi)部和外部的總 RNA 濃度，計算公式如下：
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圖 2. LNP 的表征參數(shù)與相關(guān)檢測儀器[10]。
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04
脂質(zhì)納米顆粒的發(fā)展
DEVELOPMENT OF LIPID NANOPARTICLES
LNP 是目前臨床應用上最廣泛的核酸藥物遞送載體，目前已有近 80 種基于 LNP 為遞送載體的基因藥物進入臨床開發(fā)階段，大大加速了基因治療的發(fā)展[10]。但是，LNP 在實際應用中仍存在許多問題，其一是因為 LNP 在經(jīng)過體循環(huán)后通常在肝部富集，對其他給藥器官的靶向困難[11]。其二是 LNP 只能作為載體參與藥物遞送，無法協(xié)同 mRNA 治療。
目前針對 LNP 體系的改良都和這兩個方向有關(guān)。包括通過對 LNP 基本四組分的改造與優(yōu)化增加 mRNA 遞送效率并提高安全性，或者通過引入第五組分來改善肝外靶向遞送[12]。
另外一種主流的優(yōu)化方案是通過引入帶修飾的脂質(zhì)原料，對 LNP 表面改性實現(xiàn)精準靶向。例如上面提到過的，使用馬來酰胺化 PEG 脂質(zhì)，與蛋白\抗體相連接，實現(xiàn)靶向組織、器官或細胞。
后續(xù)我們會出一期推文整理不同的修飾基團在其中的作用，以及如何設(shè)計 LNP 感興趣的老師可以繼續(xù)關(guān)注~
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產(chǎn)品推薦 |
是一種哺乳動物中的主要固醇，占質(zhì)膜結(jié)構(gòu)成分的 20-25％。 |
是一種含有 DSPE 和胺端末基的 PEG 聚合物。DSPE-PEG 2000 可用于形成膠束作為藥物遞送的納米顆粒。 |
是一種氨基脂質(zhì)，可在嚙齒動物和靈長類動物模型中提供有效的 mRNA 遞送。 |
是一種天然存在的陰離子磷脂，可以在水溶液中形成脂質(zhì)雙層，并用于生成膠束、脂質(zhì)體和其他人工膜。 |
OptiLNP RNA 轉(zhuǎn)染試劑 (肺部靶向) (HY-K2025) 是一種基于脂質(zhì)納米粒 (LNP) 技術(shù)開發(fā)的即用型轉(zhuǎn)染試劑，適用于實驗動物的 mRNA 和短鏈 RNA 通過靜脈注射給藥的肺部靶向遞送。 |
OptiLNP RNA 轉(zhuǎn)染試劑 (干細胞) (HY-K2019) 是一種基于脂質(zhì)納米粒 (LNP) 技術(shù)開發(fā)的即用型轉(zhuǎn)染試劑，適用于不同類型的 RNA 在免疫細胞中的轉(zhuǎn)染。 |
Firefly luciferase mRNA-LNP (HY-153229) 是一種已包裹 Firefly luciferase mRNA 的脂質(zhì)納米粒 (LNP)，適用于 RNA 傳遞、翻譯效率、細胞活力等檢測。 |
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參考文獻：
[1] Jung HN,et al. Lipid nanoparticles for delivery of RNA therapeutics: Current status and the role of in vivo imaging. Theranostics. 2022 Oct 24;12(17):7509-7531.
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[10] Ma Y,et al. A perspective of lipid nanoparticles for RNA delivery. Exploration (Beijing). 2024 Apr 15;4(6):20230147.
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