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北京糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)——磷酸化檢測揭示植物免疫新機(jī)制
青蓮客戶又喜提高分文章啦! 2020年10月5日，中科院微生物研究所劉俊課題組在Molecular Plant雜志（IF：12.084）上在線發(fā)表了題為“A plant lectin receptor-like kinase phosphorylates the bacterial effector AvrPtoB to dampen its virulence in Arabidopsis”的研究論文。研究報(bào)道了擬南芥凝集素受體激酶LecRK-IX.2可以與丁香假單胞菌（ Pseudomonas syringae ）效應(yīng)蛋白AvrPtoB相互作用并使其磷酸化，來削弱該效應(yīng)蛋白的毒性，從而增強(qiáng)植物免疫。很榮幸，青蓮百奧技術(shù)支持了文章中磷酸化肽段的LC-MS/MS檢測工作。下面北京糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)來給大家分享一下該文章。
研究背景
隨著植物不斷暴露于各種病原體中，在進(jìn)化過程中獲得了一套有效的先天免疫系統(tǒng)以應(yīng)對病原體的侵染。細(xì)胞膜上的模式識別受體（PRRs）可以識別病原體保守的特征物質(zhì)，如細(xì)菌的鞭毛蛋白、伸長因子和真菌的幾丁質(zhì)等，從而激活植物免疫。多種病原體可以分泌效應(yīng)蛋白進(jìn)入植物體內(nèi)，干擾PRRs對病原體的識別或其介導(dǎo)的免疫激活通路，促進(jìn)病菌致病性。效應(yīng)蛋白通過多種方式干擾PRRs的功能，如阻止其磷酸化下游信號通路組分，或直接降解PRRs等。因此，病原體的效應(yīng)蛋白的功能目前認(rèn)為是主要干擾寄主抗性的。樣本選擇
擬南芥Lecrk-IX.2和△avrPtoB突變菌株
研究結(jié)果
LecRK-IX.2可在S335位點(diǎn)磷酸化AvrPtoB
研究人員采用LC-MS/MS技術(shù)對LecRK-IX.2磷酸化的AvrPtoB進(jìn)行了分析。MS結(jié)果顯示，位于40個(gè)氨基酸的肽段中S335位點(diǎn)的磷酸化覆蓋了AvrPtoB磷酸化的 96％（圖1B），這表明AvrPtoB S335可能是LecRK-IX.2磷酸化的殘基。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，研究人員使用AvrPtoBS335 A作為LecRK-IX.2的底物進(jìn)行了體外激酶測定（S335被取代為丙氨酸）。因?yàn)橄惹暗难芯匡@示AvrPtoB T450被Pto和Fen磷酸化，所以該研究使用AvrPtoB T450A作為對照。研究發(fā)現(xiàn)，LecRK-IX.2可有效地磷酸化AvrPtoB，但無法磷酸化AvrPtoBS335 A（圖1C）。值得注意的是，LecRK-IX.2仍可以將AvrPtoBT450A磷酸化。這些結(jié)果表明，LecRK-IX.2介導(dǎo)的AvrPtoB在S335位點(diǎn)的磷酸化是特異性的，并且S335是一個(gè)被宿主蛋白磷酸化的新位點(diǎn)。
圖1. LecRK-IX.2在S335位點(diǎn)磷酸化AvrPtoB
S335位點(diǎn)的磷酸化可克制AvrPtoB的毒性
生化數(shù)據(jù)表明LecRK-IX.2使AvrPtoB磷酸化可能破壞其毒性。為了證實(shí)這一推測，研究人員首先檢查了AvrPtoB及其突變體的細(xì)菌分泌以及研究擬南芥中這些蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示在S335處AvrPtoB的磷酸化不干擾細(xì)菌分泌或其在植物中的亞細(xì)胞定位。進(jìn)一步分析表明AvrPtoB的磷酸化削弱了其對擬南芥中PTI的克制作用。研究人員評估了AvrPtoB磷酸化對植物細(xì)菌生長的影響。生長曲線分析顯示，Pst（?avrPtoB）和Pst（avrPtoBS335D）表現(xiàn)出相似的毒性。與PTI響應(yīng)一致，Pst（avrPtoBS335D）感染產(chǎn)生的細(xì)菌滴度比Pst、Pst（avrPtoBWT）或Pst（avrPtoBS335 A）感染產(chǎn)生的細(xì)菌滴度低得多。這些結(jié)果表明，在S335位點(diǎn)AvrPtoB的磷酸化減弱了其毒性。
圖2. S335位點(diǎn)AvrPtoB的磷酸化會削弱其毒性
flg22可增強(qiáng)LecRK-IX.2對AvrPtoB的磷酸化
該團(tuán)隊(duì)先前報(bào)道了flg22可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)LecRK-IX.2表達(dá)，而LecRKIX.2/IX.1參與flg22誘導(dǎo)的PTI。因此，假設(shè)flg22可以增強(qiáng)AvrPtoB磷酸化。為了證實(shí)該結(jié)果，研究人員首先檢查了flg22處理后AvrPtoB S335位點(diǎn)的磷酸化。不出所料，AvrPtoB S335位點(diǎn)在Col-0中被磷酸化，而flg22處理增加了磷酸化水平；但是，flg22誘導(dǎo)的AvrPtoB S335位點(diǎn)磷酸化很大程度上取決于LecRK-IX.2/IX.1。接下來，檢查了LecRK-IX.2對flg22處理的早期反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)flg22可能在幾分鐘內(nèi)就上調(diào)了LecRK-IX.2的表達(dá)，表明LecRK-IX.2是PTI中的早期反應(yīng)基因。
圖3. flg22通過LecRK-IX.2促進(jìn)S335位點(diǎn)的AvrPtoB磷酸化
結(jié)論
總之，該研究揭示了一種新的機(jī)制，通過該機(jī)制，植物L(fēng)ecRK蛋白LecRK-IX.2在S335位點(diǎn)處磷酸化了細(xì)菌效應(yīng)因子AvrPtoB，從而潛在地降低了其毒性。該策略可能被植物RLKs廣泛采用，在PTI響應(yīng)過程中病原體效應(yīng)因子會靶向該植物。這項(xiàng)工作實(shí)質(zhì)上提高了我們對PTI激活的認(rèn)識。此外該研究還注意到，存在去除植物中AvrPtoB
S335位點(diǎn)磷酸化的機(jī)制。這可能是為什么植物中只有一定量的AvrPtoB被磷酸化的原因。結(jié)果表明，在病原體感染期間，AvrPtoB毒性僅部分降低。
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