呼吸科什么是ngs檢測
做好相應(yīng)技術(shù)和知識準備以后，就可以入行NGS檢測了。
1、首先要解決的就是做什么的問題。
臨床遺傳疾病最常見的就是拷貝數(shù)變異（CNV）與點突變（SNV）。在以往，我們用Sanger測序檢測SNV、用CMA做CNV檢測。用Sanger方法測一個人的序列得好多年，好多好多萬美金，NGS就便宜多了，現(xiàn)在WES也就幾千塊錢，所以用來替換Sanger做基因序列檢測是最合適不過的。
CNV也是遺傳病最常見的病因之一，往常用CMA染色體基因芯片的方法來檢測，費用幾千塊?，F(xiàn)在用NGS的方法也能做，成本在WES的基礎(chǔ)上增加不多。所以可以考慮在WES檢查的同時，把CNV-Seq一起檢測了。免得分開檢測成本更高。
對于剛?cè)腴T處于學(xué)習(xí)階段的同行來說，檢測SNV+CNV就夠了，分析結(jié)果越多越容易亂。先熟悉重點問題，搞清楚NGS的適應(yīng)性和局限性。等日后經(jīng)驗豐富了，再進一步添加其他如LOH、結(jié)構(gòu)異常等檢測分析也不遲。
2、接著就是拿什么來做的問題。
a、選擇什么樣的SNV檢測方案。
現(xiàn)在常見的有wgs、wes和panal的不同方案。WGS-全基因測序，內(nèi)容全面，但比較貴，關(guān)鍵是結(jié)果太多不好分析，先放一邊。WES-全外顯子測序，是針對所有基因的外顯子進行測序，按國外文獻的統(tǒng)計，95%的已知遺傳病病因都集中在外顯子上。因為外顯子就占了全基因組的1%，所以測序量比WGS要低得多。檢出率很高，成本又比NGS低得多，這個就是WES的優(yōu)勢。
全外顯子檢測20000個基因，但人類已知的致病基因其實也就幾千個，所有還是有大部分測序浪費的。那是不是可以專門針對致病基因的外顯子，和致病的非外顯子區(qū)域一起檢測呢？是不是性價比更高？只檢查跟疾病相關(guān)的基因，這個就是醫(yī)學(xué)外顯子檢測的概念，檢出率比WES高，成本更低。不過因為遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，明確的醫(yī)學(xué)相關(guān)基因數(shù)也是越來越多，試劑盒包含的基因數(shù)從2000多、到3000多再到6000多，而且以后還會更多，所以醫(yī)學(xué)外顯子的試劑盒比較容易過時，以前做過的，以后有可能還得重做。
此外，還有一些針對特定疾病的panal（小組合），比如說把骨骼發(fā)育相關(guān)的基因湊到一起，設(shè)計一個試劑盒。這樣做的好處是基因更少，所以特定基因和突變設(shè)計得會更全面，而且測序深度也會更高，換言之，檢出率和準確率也會更高。
總體而言，臨床能力越全面，眼光越準，選擇針對性小組合的性價比越高。但疾病相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)層出不窮，每月都有大把新基因、新功能被發(fā)現(xiàn)，使用的panal越小，日后再分析，發(fā)現(xiàn)致病原因的可能性就越低。這個就需要根據(jù)個人實際情況去取舍了。
對于新人來說，挑選合適的panal有點困難，畢竟能單獨設(shè)計panal的都已經(jīng)是大神級別的人物了，自己初來乍到的，看不出好壞。所以萬事求穩(wěn)，挑選一款大而全，用戶數(shù)量多的WES一般來講比較保險。至于用什么測序平臺、哪個牌子的WES試劑盒等等問題就用不著頭疼了。挑個可靠又能給你幫助的合作伙伴才是關(guān)鍵（后面會告訴你合作伙伴怎么選），他用啥你就用啥。等攢夠了經(jīng)驗值以后，再來考慮挑哪個來用。
b、CNV用什么方案檢測的問題。
CNV有WES CNV，也有CNV SEQ（WGS CNV）。直接說我的看法吧，WES CNV雖然和WES一起就做了，不需要增加額外檢測成本，但是CNV的可靠性會更低，假陽性結(jié)果非常多，分析難度更高。畢竟WES檢測的范圍既集中、又非常不均勻；局部位置太窄，連續(xù)區(qū)域又太疏、隔得太遠。在WES的基礎(chǔ)上添加WGS CNV增加不多的成本，就可以得到穩(wěn)定可靠的CNV SEQ結(jié)果。所以我個人認為，選擇WES+CNV SEQ是性價比最高的。起步的時候分析WGS CNV就夠了，日后技術(shù)熟悉了，再撈WES的CNV來看，起步工作和發(fā)展方向都有了。
特別說明一下，這里的WES+CNV SEQ不是說WES和WGS分別去檢測，這樣成本就高了；而是WES實驗做到一半的時候，取建庫后尚未進行下一步操作的產(chǎn)物去進行WGS的CNV SEQ測序，這樣一個實驗兩用，成本最便宜，當(dāng)然操作會麻煩一些。
3、然后是誰來做，如何安排檢測流程，怎么分工的問題。
搞清楚了要做什么(wes+ngs seq)、拿什么來做(Wes或cwes)的問題，接下來進入今天的核心，技術(shù)流程和分工的問題。
先說結(jié)論，我個人推薦先找第三方全包檢測、自己做好臨床服務(wù)，再根據(jù)需求逐步涉足實驗和分析過程。
一開始就全系列自己完成檢測是否可行？不現(xiàn)實，除非能夠收集齊實驗、遺傳、生信、臨床的全套經(jīng)驗豐富的團隊，否則要管理、控制、協(xié)調(diào)的環(huán)節(jié)太多，做不下來。
能否長期完全依賴第三方呢？也不能！臨床的結(jié)論需要臨床醫(yī)務(wù)人員親力親為自己去根據(jù)臨床信息、檢測結(jié)果推導(dǎo)出來。第三方終究不直接接觸病人，檢測結(jié)果到最終報告之間差了一環(huán)。你見過檢驗科同事拿著血常規(guī)報告直接給病人下診斷治療的嗎？換成高級檢驗科也不行。
確定了攜手合作，共同服務(wù)的模式之后，根據(jù)經(jīng)驗和分工的不同，可以分為以下幾個階段。
第一階段：技能準備。遺傳學(xué)基本技術(shù)和基本知識的準備階段；
第二階段：測序入門。了解NGS方案的異同，學(xué)習(xí)掌握NGS遺傳咨詢的特點；
第三階段：分析進階。掌握常用軟件、文獻檢索，能結(jié)合臨床出具臨床報告；
第四階段：挑戰(zhàn)生信。熟悉各類生信軟件、根據(jù)需求自由取用，能結(jié)合臨床給出科研建議；
第五階段：團隊創(chuàng)新。能總結(jié)臨床需求，自定義開發(fā)實驗方法、數(shù)據(jù)算法，設(shè)計panal；
各個階段的工作分工大致是下面的狀態(tài)，向右的箭頭“→→→”用來區(qū)分不同的團隊。
階段二，入門
合作流程：臨床→→→遺傳咨詢+實驗室+遺傳咨詢→→→臨床；
階段三，進階
合作流程：臨床+遺傳咨詢→→→實驗室→→→遺傳咨詢+臨床；
階段四，生信
合作流程：臨床+遺傳咨詢→→→測序+數(shù)據(jù)分析→→→臨床生信分析+遺傳咨詢+臨床；
階段五，創(chuàng)新
服務(wù)流程：臨床+遺傳咨詢+測序+數(shù)據(jù)分析+生信分析，大團隊整合，想做什么就開發(fā)什么。
我們都知道，WES是個臨床檢測，意思就是說，如果不提供臨床信息，WES實驗做得再漂亮也是出不了報告的。這還不是最糟糕的，更坑爹的地方在于，即使臨床信息給得不準，也能出來一份看上去特別像真的，但其實是錯誤的報告。比如一個健康成年大活人，你給他貼個新生兒死亡的標簽，很可能就會檢測到新生兒死亡相關(guān)的基因突變。
對于初學(xué)者，你敢說自己采集與描述的臨床表型就是準確的嗎？所以，在入門階段，你要得不是一份報告，而是一個檢驗與遺傳咨詢團隊。一個能教你怎么去搜集表型，需要采集哪些表型，采集到的表型怎么用標準化詞匯表示，怎么去跟基因測序結(jié)果核對，怎么去跟病人解釋的合作伙伴。當(dāng)然，你也可以通過進修、通過發(fā)帖子請教、通過遠程會診等各種形式去學(xué)習(xí)，但畢竟誰都知道乙方不好當(dāng)，能夠自己當(dāng)甲方讓供應(yīng)商直接手把手教你會有效得多。況且能夠參與臨床討論對于甲方也是一件好事，誰不想自己的報告更準確，自己的團隊水平更高啊。這件事對雙方都是共贏，除非是不打算在遺傳領(lǐng)域深耕的，都在應(yīng)該能一拍即合。
不要去在意服務(wù)供應(yīng)商跟你說的，服務(wù)有多好，背景有多強，就算是院士領(lǐng)銜，也不可能每次都找院士來教你怎么做體格檢查吧？掂量一下你能夠經(jīng)常見得到人的，能實際得到的實實在在的指導(dǎo)和幫助是怎么樣的，這個才是最實在的。
關(guān)于CNV檢測，你需要找一家可靠的合作伙伴。
如果說SNV檢測的關(guān)注點在于需要一個熟悉臨床的咨詢師來引導(dǎo)入門。那么CNV SEQ的關(guān)注點就在可靠性上面。不像CMA芯片在臨床上的應(yīng)用已經(jīng)有很多年了，產(chǎn)品已經(jīng)經(jīng)受了時間的考驗，能流傳下來的芯片，隨便哪款拿來就能用。CNV SEQ歷史較短，具體的測序深度、算法流程也存在非常大的差異，所以可靠性差異很大。光憑直覺，我們也會猜到WGS的測序量越大，CNV的準確性就越高，但到底使用多少數(shù)據(jù)量能對應(yīng)怎樣的準確率還缺乏明確的標準。在商言商，盡可能使用更低的數(shù)據(jù)量達到更高的檢出率自然是商家追求的目標，但是否影響結(jié)果的可靠性只有長期大量數(shù)據(jù)的積累和驗證才知道。初始合作伙伴選擇上，可以看看口碑、看既往案例；不要看廣告做得怎么樣、規(guī)模有多大、淘寶有刷單的，第三方也可以。多聽聽用戶的意見，找那些做了很多年芯片又開了CNV SEQ的用戶來問，交口稱贊的總比名聲臭大街的好。但是事物總是在變化的，技術(shù)發(fā)展非?？?，很難說哪家機構(gòu)就能一直獨占鰲頭、長久第一。個人覺得重點還是在于盡快學(xué)會自己分析，跳過這一環(huán)節(jié)，自己來把關(guān)才放心。
4、結(jié)果驗證。
不論是SNV還是CNV，都是存在不少假陽性現(xiàn)象的，況且實驗室質(zhì)控再好，也難保不會出錯。這個時候前面講的準備工作中的驗證方法就能用上了。等到驗證得多了，臨床經(jīng)驗豐富了，對于NGS哪些結(jié)果是可靠的，哪些是不靠譜的需要驗證的就有了更深刻的體會，就不需要常常驗證了。
總之，對于新手來說，選擇一個具有臨床遺傳咨詢能力、并且能夠提供及時指導(dǎo)的供應(yīng)商；在其幫助下完善自己的臨床遺傳咨詢師培訓(xùn)，是非常有必要的，是開展NGS的最佳選擇。等到醫(yī)院的臨床醫(yī)生具備了遺傳咨詢能力，能夠全面接手檢測前和報告后的臨床遺傳咨詢時，就可以考慮往下一階段，接手實驗室遺傳咨詢師的工作進發(fā)了；等自己的實驗室遺傳分析流程都建立好了、穩(wěn)定了，檢測報告才算真正靠譜了，NGS的價值也才算發(fā)揮出來了。如果一直只用第三方的檢測報告，結(jié)果的可靠性終究要打折扣，畢竟他們?nèi)鄙傧襻t(yī)院那樣位于臨床一線親身采集臨床信息的機會。
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