全血中提取白細胞的方法
中性粒細胞分離的方法
1、 標準方法：Ficoll-泛影鈉（Ficoll-Hypaque）密度梯度及紅細胞裂解法
1） 取一50ml聚乙烯管，無菌采集人外周靜脈血，加4.4ml3.8%或5%的檸檬酸鹽液定容至40ml。上述全血300gX20min，離心，室溫。
2） 吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。
3） 余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000，用無菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調(diào)節(jié)最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。
4） 吸出富含白細胞的上層液，275gX6min。
5） 沉淀的細胞用8mlPPP-生理鹽水（1：4）重懸，并移到15ml離心管中。
6） 懸液細胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室溫。
7） 吸取富含中性粒細胞和紅細胞層，用0.155M NH4Cl重懸細胞，使紅細胞裂解，然后中性粒細胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，無鈣）洗2次，最終用HBSA（含鈣）重懸。
8） 用此法可得95%以上的中性粒細胞。
2、 不連續(xù)的密度梯度血漿－Percoll離心法
1） 先制備Percoll儲存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的體積比為9：1。
2） 取一50ml聚乙烯管，無菌采集人外周靜脈血，加4.4ml3.8%或5%的檸檬酸鹽液定容至40ml。上述全血300gX20min，離心，室溫。
3） 吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。
4） 余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000，用無菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調(diào)節(jié)最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。
5） 吸出富含白細胞的上層液，275gX6min。
6） 沉淀的細胞用2~3mlPPP重懸
7） 在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、2~3ml細胞懸液，275gX10min.
8） 單個核細胞及部分血小板位于血漿與42%Percoll液之間，中性粒細胞位于42%Percoll與51%Percoll之間。血小板可通過25%Percoll離心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三個25%Percoll一起離心去除。
9） 中性粒細胞層用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸緩沖液（KRPD，PH7.23）洗1次。
10）用這種方法可得80%中性粒細胞，純度在95%以上。
3、“無LPS”方法（LPS-Free method)
1）已有用變形細胞（如白細胞）裂解的方法表明，容器及溶液的不含LPS，也就是說，LPS的含量小于0.1ng/ml。
2) 無菌采集靜脈血，用10%檸檬酸鈉抗凝。
3）抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000)，比例為3：1（vol/vol,blood/dextran），室溫，1小時。
4) 收集白細胞的血漿，離心，去上清。
5）紅細胞用低滲的0.2%NaCl裂解15秒（此步也可用0.155M NH4Cl 15秒代替）
6）離心前立即加入10ml 1.6%NaCl（含糖(dextrose) 2mg/ml）
7) 離心后用KRPD洗2次。
8）此法得到中性細胞數(shù)與方法2類似，但純度只有80-85%，余下為淋巴細胞及單核細胞。
8）此法得到中性細胞數(shù)與方法2類似，但純度只有80-85%，余下為淋巴細胞及單核細胞。
4 從3中所獲得的中性粒細胞進行純化
1） 因為方法3只能獲得80－85%純度的中性粒細胞，可以把方法2與方法3聯(lián)合對中性粒細胞進行純化。
2） 收集從方法3 dextran沉降所得到的富含白細胞的血漿，275g*6min，離心。
3） 管底沉淀用2ml PPP重懸
4） 在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、2~3ml細胞懸液，275gX10min。
5） 分別用PPP及KRPD各洗1次
6） 用這種方法所得的中性粒細胞純度高達99%以上，并且中間不需要紅細胞裂解的步驟。
krebs-Ringer phosphate（KRPD緩沖液）的配制： 130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4
配制方法：
A液：NaCl 7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g，glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解；
B液：NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g，加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O 0.3130g，充分溶解。
將A、B混合，用ddH20將體積調(diào)節(jié)至990ml左右，用1M NaOH或1M HCl調(diào)節(jié)pH至7.2~7.4，定容至1000ml。
