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2020年版中國藥典-四部：9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

2022.3.25

9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則

　　分析方法驗(yàn)證（analytical method validation）的目的是證明建立的方法適合于相應(yīng)檢測要求。在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、變更藥品生產(chǎn)工藝或制劑組分、修訂原分析方法時(shí)，需對分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。生物制品質(zhì)量控制中釆用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測定方法，其中理化分析方法的驗(yàn)證原則與化學(xué)藥品基本相同，所以可參照本指導(dǎo)原則進(jìn)行，但在進(jìn)行具體驗(yàn)證時(shí)還需要結(jié)合生物制品的特點(diǎn)考慮；相對于理化分析方法而言，生物學(xué)測定方法存在更多的影響因素，因此本指導(dǎo)原則不涉及生物學(xué)測定方法驗(yàn)證的內(nèi)容。

　　驗(yàn)證的分析項(xiàng)目有：鑒別試驗(yàn)、雜質(zhì)測定（限度或定量分析）、含量測定（包括特性參數(shù)和含量/效價(jià)測定，其中特性參數(shù)如：藥物溶出度、釋放度等）。

　　驗(yàn)證的指標(biāo)有：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性。在分析方法驗(yàn)證中，須用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。由于分析方法具有各自的特點(diǎn)，并隨分析對象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗(yàn)證的指標(biāo)。表1中列出的分析項(xiàng)目和相應(yīng)的驗(yàn)證指標(biāo)可供參考。

　　①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度。

　?、谌缫环N方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充。

　?、垡暰唧w情況予以驗(yàn)證。

　　方法驗(yàn)證內(nèi)容如下。

　　一、專屬性

　　專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測定出被測物的能力。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查和含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)采用一種或多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。

　　1. 鑒別反應(yīng)

　　應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似的化合物。不含被測成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反應(yīng)。

　　2. 含量測定和雜質(zhì)測定

　　采用的色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。

　　在雜質(zhì)對照品可獲得的情況下，對于含量測定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測定結(jié)果。對于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分離。

　　在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進(jìn)行強(qiáng)制破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑對含量測定和雜質(zhì)測定的影響。含量測定方法應(yīng)比對兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢查應(yīng)比對檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光電二極管陣列檢測和質(zhì)譜檢測，進(jìn)行峰純度檢查。

　　二、準(zhǔn)確度

　　準(zhǔn)確度系指用所建立方法測定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收率（%）表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)試驗(yàn)。準(zhǔn)確度也可由所測定的精密度、線性和專屬性推算出來。

　　在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)；或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)行測定，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，且濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。兩種方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。

　　1. 化學(xué)藥含量測定方法的準(zhǔn)確度

　　原料藥可用已知純度的對照品或供試品進(jìn)行測定，或用所測定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測物對照品進(jìn)行測定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定，或用所建立方法的測定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測定結(jié)果進(jìn)行比較。

　　2. 化學(xué)藥雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度

　　可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)對照品進(jìn)行測定。如不能得到雜質(zhì)對照品，可用所建立的方法與另一成熟方法（如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法）的測定結(jié)果進(jìn)行比較。

　　3. 中藥化學(xué)成分測定方法的準(zhǔn)確度

　　可用已知純度的對照品進(jìn)行加樣回收率測定，即向已知被測成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測成分對照品，依法測定。用實(shí)測值與供試品中含有量之差，除以加入對照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須注意對照品的加入量與供試品中被測成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對誤差，過大則干擾成分相對減少，真實(shí)性差。

　　4. 數(shù)據(jù)要求

　　對于化學(xué)藥應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率（％），或測定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間（置信度一般為95%）；對于中藥應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對照品加入量、測定結(jié)果和回收率（%）計(jì)算值，以及回收率（%）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）或置信區(qū)間。樣品中待測定成分含量和回收率限度關(guān)系可參考表2。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。

　　此表源自AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methodsfor Dietary Supplements and Botanicals》。

　　三、精密度

　　精密度系指在規(guī)定的測定條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

　　在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的條件改變，如不同時(shí)間、不同分析人員、不同設(shè)備等測定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；不同實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。

　　含量測定和雜質(zhì)的定量測定應(yīng)考察方法的精密度。

　　1. 重復(fù)性

　　在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)；或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)行測定，用至少9份樣品的測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。采用至少9份測定結(jié)果進(jìn)行評價(jià)時(shí)，濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。

　　2. 中間精密度

　　考察隨機(jī)變動因素，如不同日期、不同分析人員、不同儀器對精密度的影響，應(yīng)進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。

　　3. 重現(xiàn)性

　　國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過不同實(shí)驗(yàn)室協(xié)同檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)所用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果。

　　4. 數(shù)據(jù)要求

　　均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考表3（可接受范圍可在給出數(shù)值0.5～2倍區(qū)間，計(jì)算公式，重復(fù)性：RSDr=C-0.15；重現(xiàn)性：RSDR=2C-0.15其中C為待測定成分含量）。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度限度可適當(dāng)放寬。

　　此表源自AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methodsfor Dietary Supplements and Botanicals》。

　　四、檢測限

　　檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。檢測限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。常用的方法如下。

　　1. 直觀法

　　用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測出的最低濃度或量。

　　2. 信噪比法

　　用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測出的被測物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3︰1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測限。

　　3. 基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

　　按照LOD=3.3δ/S公式計(jì)算。式中LOD：檢測限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

　　δ可以通過下列方法測得：①測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

　　4 .數(shù)據(jù)要求

　　上述計(jì)算方法獲得的檢測限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測定圖譜，說明試驗(yàn)過程和檢測限結(jié)果。

　　五、定量限

　　定量限系指試樣中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。對微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。

　　1. 直觀法

　　用已知濃度的被測物，試驗(yàn)出能被可靠地定量測定的最低濃度或量。

　　2. 信噪比法

　　用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進(jìn)行比較，計(jì)算岀能被可靠地定量的被測物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10︰1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。

　　3. 基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

　　按照LOQ=10δ/S公式計(jì)算。式中LOQ：定量限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

　　δ可以通過下列方法測得：①測定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

　　4. 數(shù)據(jù)要求

　　上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測試圖譜，說明測試過程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

　　六、線性

　　線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，線性試驗(yàn)結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈比例關(guān)系的能力。

　　應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測定線性關(guān)系?？捎猛粚φ掌焚A備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對照品，制備一系列對照品溶液的方法進(jìn)行測定，至少制備5個(gè)不同濃度水平。以測得的響應(yīng)信號作為被測物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，或者可釆用描述濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。

　　數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、殘差平方和、線性圖（或其他數(shù)學(xué)模型）。

　　七、范圍

　　范圍系指分析方法能達(dá)到精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。

　　范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%～120%；制劑含量均勻度檢查，范圍一般為測定濃度的70%～130%，特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的士30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的一20%至上限的+20%；雜質(zhì)測定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行含量測定和純度檢查，且僅使用100%的對照品，線性范圍應(yīng)覆蓋雜質(zhì)的報(bào)告水平至規(guī)定含量的120%。

　　在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。溶出度或釋放度中的溶出量測定，范圍一般為限度的±30%。

　　八、耐用性

　　耐用性系指在測定條件有小的變動時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明，并注明可以接受變動的范圍，可以先采用均勻設(shè)計(jì)確定主要影響因素，再通過單因素分析等確定變動范圍。典型的變動因素有被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間等。液相色譜法中典型的變動因素有流動相的組成和pH值、不同品牌或不同批號的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相色譜法變動因素有不同品牌或批號的色譜柱、不同類型的擔(dān)體、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。

　　經(jīng)試驗(yàn)，測定條件小的變動應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法的可靠性。

分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中國藥典 2020

2020年版中國藥典

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