標(biāo)準(zhǔn)曲線響應(yīng)因子計(jì)算
1.概述
1.1.相對響應(yīng)因子(Relative response factor，RRF)的概念
RRF一般應(yīng)用于原料藥或者藥物制劑色譜分析方法中，對有關(guān)物質(zhì)(如雜質(zhì)或者降解雜質(zhì))的精確定量或者活性藥物原料(API)的純度檢查。用于校正不同化合物在不同的分析方法中檢測器信號響應(yīng)的差異，一般為各種雜質(zhì)對于API的相對信號響應(yīng)，各國藥典(包括USP，EP，BP等)對其表述大同小異，可簡單描述為：單位質(zhì)量(質(zhì)量濃度)的雜質(zhì)與API的檢測信號響應(yīng)之比(RFimp/RFapi)。
1.2.影響RRF的因素
影響RRF的因素有很多，其中包括化合物本身的性質(zhì)也包括分析方法條件的設(shè)置，以配置PDA檢測器的HPLC分析方法為例，將RRF影響因素列于下表1中(不限于)。
HPLC以及GC是制藥行業(yè)應(yīng)用最多的分析儀器，其配置的各種檢測器包括通用型檢測器以及一些化合物特異性檢測器，如GC通用型FID檢測器對幾乎所有有機(jī)化合物均有較好的響應(yīng)，ECD，F(xiàn)PD檢測器則是檢測譜相對比較窄的化合物特異檢測器；HPLC通常配置的PDA，ELSD，CAD，MSD檢測器均為通用型檢測器，CLND作為一款化合物特異性檢測器則不常用。不同的化合物在不同的檢測器下往往具有不同的響應(yīng)因子(RF，如PDA檢測器的不同檢測波長下RRF有可能差異很大)，在使用色譜積分面積百分比考察樣品純度時(shí)，就需要以API的RF為基準(zhǔn)對相關(guān)雜質(zhì)的RFs做校正，保證樣品純度測試結(jié)果的準(zhǔn)確可信。
除上述所列的分析條件的改變會影響RRF之外，其他任何常見的方法的改變亦會影響RRF。在使用PDA作為檢測器，其他分析條件既定的情況下，波長的選擇對于RRF的影響是絕對影響因素，不同的化合物具有不同的紫外吸收光譜(無共軛作用化合物一般無紫外吸收)，因此在不同的檢測波長下，RRF測定值有所區(qū)別(以下RRF均以PDA作為HPLC檢測器)。
1.3.RRF的應(yīng)用范圍
RRF在不同目的的分析方法中均有廣泛的應(yīng)用，如In-Process-Control，純度檢測，Mass balance調(diào)查，雜質(zhì)限度測試與制定以及Stability/Impurity indicating(按照ICH Q3B R2要求，RRF在0.8-1.2)等。
在API工藝研發(fā)過程中，In-Process-Control分析方法(HPLC)需要對反應(yīng)過程進(jìn)行監(jiān)測與控制并以原料的轉(zhuǎn)化率或剩余量設(shè)定合適的反應(yīng)終點(diǎn)，在對色譜圖處理時(shí)一般采取面積歸化法判斷反應(yīng)是否到達(dá)終點(diǎn)。如果原料與產(chǎn)物之間RRF超出范圍(0.8-1.2，就需要對其進(jìn)行RF校正之后再以面積歸一化法，報(bào)告檢測結(jié)果。
在純度以及Stability/Impurity indicating測試時(shí)，更應(yīng)該對相關(guān)雜質(zhì)或相關(guān)降解雜質(zhì)的RRF進(jìn)行測試。尤其是在Stability/Impurity indicating測試時(shí)，各種降解條件（參照ICH Q series）產(chǎn)生的相關(guān)降解雜質(zhì)UV譜有可能保持相對一致（分子母核保持不變，活性基團(tuán)降解，交換等），也有可能差異較大或者吸收很弱甚至在該檢測波長下無明顯的紫外吸收（如含氮、硫雜環(huán)開環(huán)等）；此時(shí)，若不對RF進(jìn)行校正，則極易引入Mass balance問題。在對RF不一致導(dǎo)致的Mass balance問題進(jìn)行調(diào)查時(shí)，與UV聯(lián)用ELSD或者CAD檢測器一般會有助于發(fā)現(xiàn)該問題（下圖1A以及1B）。
此外，雜質(zhì)限度測試與制定亦需要對其RRF進(jìn)行測試，以此對其絕對含量進(jìn)行校正。
2.RRF測定方法
RRF的測定方法有很多，包括以PDA作為檢測器直接測定，也有間接測定方法，實(shí)際測定時(shí)需要根據(jù)具體條件以及資源可利用情況，靈活做出選擇。
2.1RRF直接測定法
PDA檢測器作為一款濃度型通用型檢測器，具有最寬泛的應(yīng)用范圍。其信號響應(yīng)與化合物的濃度呈直接線性相關(guān)，其基本構(gòu)造如下圖2所示。
依據(jù)RRF被廣泛接受的定義，利用RRF=(Response Areaimp/Concentrationimp)/(Response Areaapi/Concentrationapi)可對其以PDA作為檢測器進(jìn)行直接測定。直接測定需要得到對照品級別的相關(guān)物質(zhì)或雜質(zhì)以及API，具體有以下幾種方法：
（1）單濃度點(diǎn)法，準(zhǔn)備已知濃度的特定物質(zhì)/雜質(zhì)對照品和API溶液，可分別進(jìn)樣也可作為混合溶液HPLC進(jìn)樣，按照上式計(jì)算RRF。
?。?）多濃度點(diǎn)法，準(zhǔn)備高、中、低濃度的特定物質(zhì)/雜質(zhì)對照品和API對照品溶液（注意樣品濃度不能超載），HPLC進(jìn)樣并計(jì)算RRF，以平均值作為最終RRF。
?。?）標(biāo)準(zhǔn)曲線法，分別制備0.1%-1.0%的系列濃度溶液（涵蓋定量限），得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線斜率之比即為RRF。
?。?）吸收系數(shù)法：PDA作為檢測器時(shí)，RRF為相關(guān)物質(zhì)于檢測波長處的紫外吸收系數(shù)之比，可按照A=lg(1/T)=Kbc分別計(jì)算K，摩爾吸光系數(shù)，之后以各自相對分子質(zhì)量校正之后相比得到RRF。
從上述表述中亦可以看出直接法測定相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)的RRF，均需要得到對照品級別或者已知重量含量的相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)，很多時(shí)候并不能到達(dá)該要求。如Stability/Impurity indicating測試時(shí)，不可能事先準(zhǔn)備相關(guān)降解雜質(zhì)，盡管在雜質(zhì)之后得到這些降解雜質(zhì)的Impurity profile并利用Q-TOF得到相關(guān)雜質(zhì)的精確分子量或者花費(fèi)大量資源明確其結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對其進(jìn)行合成亦需要自此花費(fèi)大量的人力以及物力（不具備制備需要的量）。而有時(shí)，縱然花費(fèi)了大量的人力、物力，短時(shí)間內(nèi)也不一定能夠?qū)ζ溥M(jìn)行合成以及純化。
2.2 RRF間接測定法
間接測定法主要是指將UV-PDA檢測器與其他濃度相關(guān)型檢測器如CAD，ELSD，CLND，MSD等進(jìn)行串聯(lián)（串聯(lián)方式如下圖3所示），進(jìn)而對RRF進(jìn)行測定。
CAD（charged aerosol detector，電噴霧檢測器）作為另外一款通用型HPLC檢測器具有靈敏度高，不同化合物的響應(yīng)一致（表2），重現(xiàn)性好，檢測范圍較寬且信號響應(yīng)不依賴與化合物本身的共軛性質(zhì)等特點(diǎn)，但受流動相的組成變化影響較大，其簡單工作原理如下圖4所示。
在較寬濃度范圍內(nèi)，CAD檢測器的信號響應(yīng)與樣品濃度并不呈直接線性相關(guān)，而具有Y=aXb的關(guān)系（Y，色譜積分面積；X，樣品濃度），但在較窄的濃度范圍內(nèi)（0.1%-1.0%）則呈現(xiàn)較好的直接線性相關(guān)。此外，CAD對于結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物表現(xiàn)出信號響應(yīng)的高度一致性，特別適合于Stability/Impurity indicating樣品進(jìn)行分析。
在以UV-CAD串聯(lián)的方式對RRF進(jìn)行測定時(shí)，可按照下式進(jìn)行計(jì)算
在以Gradient方式對樣品進(jìn)行分析時(shí)，為消除梯度變化對于RRF的影響，可在樣品中添加已知濃度的已知雜質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)對計(jì)算方式進(jìn)行校正，或者使用雙梯度（圖5A與5B）對RRF進(jìn)行校正。
下圖6為典型Stability/Impurity indicating樣品利用UV-CAD對相關(guān)降解雜質(zhì)進(jìn)行分析并測定RRF的色譜圖，其中圖6A為已知結(jié)構(gòu)以及濃度的9個(gè)相關(guān)物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)）的UV-CAD圖譜，圖6B為降解樣品UV-CAD圖譜。
其中Photodegradant雜質(zhì)為光降解雜質(zhì)，為加入的內(nèi)標(biāo)之一，以直接測定法得到的RRF與UV-CAD法測得的RRF進(jìn)行比較，表3，可以看出兩種測定方式保持了高度一致性。
ELSD（charged aerosol detector，電噴霧檢測器）作為與CAD類似的檢測器，同樣可以UV-ELSD的方式對相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)的RRF進(jìn)行測試。與CAD類似，信號響應(yīng)與樣品濃度并不呈直接線性相關(guān)，而具有Y=aXb的關(guān)系，但在較窄的濃度范圍內(nèi)（0.1%-1.0%）則呈現(xiàn)較好的直接線性相關(guān)，RRF計(jì)算方式可參照CAD檢測器。
其檢測性能上要稍遜與CAD檢測器，具有與CAD檢測器一樣的缺點(diǎn)，即RF對流動相的組成變化比較敏感，但可以以同樣的方式克服，其基本檢測原理如下圖7所示。
與CAD檢測器類似地，樣品從色譜柱流出之后經(jīng)過霧化，蒸發(fā)，檢測三步。下圖8為將HPLC-UV-ELSD應(yīng)用于某一API在酸性環(huán)境下降解樣品的分析以及相關(guān)雜質(zhì)RRF的測定。
該實(shí)例分別測試了50 ug/mL以及125 ug/mL濃度的API中的相關(guān)降解雜質(zhì)的RRF，如下表4所示。
上述數(shù)據(jù)說明UV-ELSD的方式可以對相關(guān)雜質(zhì)的RRF進(jìn)行簡單測定，且在228 nm的檢測波長下，降解雜質(zhì)B的RRF超過0.8-1.2的范圍，需要對分析方法的檢測波長進(jìn)一步優(yōu)化選擇。
一般地，MSD檢測器不能以與UV-PDA檢測器聯(lián)用的方式測定相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)的RRF，這是因?yàn)椴煌幕衔锲潆x子化能力不一樣，導(dǎo)致信號響應(yīng)與化合物的濃度之間很難建立起一定的數(shù)學(xué)模型。但其可以結(jié)合CLND檢測器(Chemiluminescent Nitrogen-specific Detector，氮化學(xué)發(fā)光檢測器)一起與UV-PDA聯(lián)用對RRF進(jìn)行測定(CLND工作原理簡圖如圖9A，氮化學(xué)發(fā)光原理如圖9B)。
該檢測器的信號響應(yīng)與樣品分子的氮含量呈線性關(guān)系，檢測限度可達(dá)ng氮級別(如圖10)，但改檢測器只對含氮化合物具有響應(yīng)(但不能含有N=N以及N-N結(jié)構(gòu))，流動相不能使用乙腈以及含氮添加劑。
以CLND檢測器串聯(lián)UV-PDA檢測器測定相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)的RRF，往往需要知道該物質(zhì)/雜質(zhì)的精確分子量進(jìn)而計(jì)算其分子式，確定其含有幾個(gè)氮原子。RRF的計(jì)算可按照下式進(jìn)行。
其典型應(yīng)用圖譜如下圖11所示，測定結(jié)果見下表5。
3. 結(jié)論
RRF作為重要的色譜方法學(xué)參數(shù)，其值取決于化合物本身的紫外吸收光譜性質(zhì)以及所用PDA檢測器的波長，測定準(zhǔn)確的RRF值對于相關(guān)物質(zhì)/雜質(zhì)研究非常重要。直接法測定簡單，易于操作，但往往需要得到已知重量含量的較純樣品，因此尋找其他可替代間接方法對RRF進(jìn)行測定具有比較現(xiàn)實(shí)的意義。以HPLC-UV串聯(lián)CAD，ELSD或者CLND檢測器的方式對RRF進(jìn)行測定，可不用獲得較純樣品，實(shí)現(xiàn)在線測定。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要以及資源可支配情況，進(jìn)行靈活選擇。
