人 乳腺癌標志物 -CA153 酶聯免疫分析（ELISA ）

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用 ? ????? 目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中 乳腺癌標志物 -CA153 的 含量。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人 乳腺癌標志物 -CA153 水平。用純化的人 乳腺癌標志物 -CA153 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 乳腺癌標志物 -CA153 ，再與 HRP 標記的 乳腺癌標志物 -CA153 抗體結合，形成抗體 - 抗原 - 酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 乳腺癌標志物 -CA153 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（ OD 值），通過標準曲線計算樣品中人 乳腺癌標志物 -CA153 濃度。

試劑盒組成 ：

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樣本處理及要求 ：

1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬 /ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?2-8 ℃的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉 / 分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可 將標本放于 -20 ℃保存，但 應避免反復凍融 .

7. 不能檢測含NaN3的樣品 ，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP ）活性。

操作步驟

1.???????? 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加標準品 100μl ，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液 50μl ，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl ，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl ，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl ，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl ，濃度分別為 48 I U /ml ， 32 I U /ml ， 16 I U /ml ， 8 I U /ml ， 4 I U /ml ）。

2.???????? 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、 待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 50 μ l ，然后再加待測樣品 10 μ l （樣品最終稀釋度為 5 倍）。 加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.???????? 溫育：用封板膜封板后置 37 ℃溫育3 0 分鐘。

4.???????? 配液：將 30 （ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。

5.???????? 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。

6.???????? 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl ，空白孔除外。

7.???????? 溫育：操作同 3 。

8.???????? 洗滌：操作同 5 。

9.????????