一、篩選之前確定G418濃度：

1、由于每種細(xì)胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為0.722g。

2、G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。但是新霉素對真核細(xì)胞無作用而G418對細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。neo就是編碼3′磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋白能夠分解新霉素和G418。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞膜受到影響，抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時(shí)不加其它抗生素。

3、匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50%。

4、G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。

一個(gè)具體試驗(yàn)：3*106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。

二、加藥時(shí)間和維持濃度：

1、由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝,G418的濃度和活性都會(huì)下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。

2、加抗生素的時(shí)機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是篩選濃度的1/2。

關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且，如果你要挑選到幾個(gè)陽性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。

三、篩選時(shí)的培養(yǎng)液：

加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：

1、死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時(shí)換液。

2、孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。

3、適當(dāng)增加血清濃度。

四、篩選時(shí)出現(xiàn)的問題及其解決辦法：

1、問題1.做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近），就是說幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？

a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；

b、加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；

c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走你的可隆了呀；

d、具體消化的時(shí)間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細(xì)胞尚未完全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。

我的建議：1、在100mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。2、把細(xì)胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆。