實驗目的

動物的游離細胞以及植物成微生物去壁后的原生質(zhì)體，在電刺激下進行細胞融合，且融合率高、無毒性，操作簡便及融合后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)成活率高等優(yōu)點，是細胞工程手段的又一進展。

實驗原理

將制備的游離細胞或原生質(zhì)體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化，成為偶極子，造成細胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長，則細胞連接成串珠狀，應適當控制以上條件，盡量使兩細胞處于點接觸狀態(tài)，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點部位的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩細胞融合逐步完全。

實驗用品

一、儀器JCF-I型細胞電融合儀、細胞融合池、普通離心機、倒置顯微鏡(或研究用顯微鏡)，刻度吸管、不銹鋼網(wǎng)(200目)、鑷子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛細吸智、刻度吸蕾。小燒杯(10m1)、滴瓶、培養(yǎng)皿、毛筆等。

二、藥品

甘露醇、氧化鈉，纖罐索醇(Onozura R-10)、離析酶(Macerozyme R-10)、蝸牛酶(中科院生物物理所產(chǎn))、CaCl2、2H2O、MES (2-N-嗎啉乙烷磺酸)、葡聚糖硫酸鉀等。

實驗方法

本實驗所有步驟均可在有菌條件下操作。

一、植物原生質(zhì)體的制備

1、取幼嫩的葉片或充分展開的子葉，先用水洗凈并吸去表面的水份，再置入小燒杯中將葉片剪成碎塊。

2、將碎塊放入1.5％纖維素酶、0.3％離析酶、0.5％蝸牛酶、0.6mol/L甘露醇、50mmol/L CaCl2·2H20、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸鉀0.3％，pH5.6的酶液中，置于25℃暗處游離5h(或15℃過液)，游離時間結(jié)束時，可鏡檢原生質(zhì)體分離情況，如果大多數(shù)原生質(zhì)體還未從組織中釋放出來，需增加在酶液中的游離 時間。新出廠的酵在5h內(nèi)一般就可將原生質(zhì)體游離出來，但因藥品質(zhì)量問題或存放時間過長，致使酶活力下降，要適當延長酶解時間。

3、將醇解出來的原生質(zhì)體用不銹鑰網(wǎng)過濾，以除去未被酶解的組織，過濾后用0.6M的蔗糖沖洗網(wǎng)上殘留的原生質(zhì)體，然后以200r/min進行離心處理5min。

4、用帶長針頭的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O，將原生質(zhì)體混勻。

5、用細頭滴管或帶長針頭的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液，再以300r/min離心10min，此時可見到在上下兩液體間的界面處有一層乳白質(zhì)的帶狀物，即為純凈的原生質(zhì)體，其破碎的部份及其它雜質(zhì)都沉降到離心管底部，用長針頭注射器或毛細吸臂分別吸去管底的雜質(zhì)和蔗蔗糖液以及原生質(zhì)體上層的 CaCl2液。

6、向離心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液，混勻后以300r/min離心5min去掉上清液，量后用0.6mol/L的甘露醇溶液稀釋并調(diào)整每毫升含5×104個原生質(zhì)體。

二、動物細胞的制備

用滅菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸鈉0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至100ml）lml，再從雞的翼下靜脈取血0.5--1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2--3ml Alsver液，使總量為4--5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用，實驗時取貯備的雞血細胞lml，加入4ml85％生理鹽水，混勻后以1200rr/min離心5min，去上清液后，最后用0.6mol/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混勻后以上述離心條件洗滌兩次，最后用0.6mol/L的甘露醇液將雞細胞稀釋并調(diào)整成每毫升含2×105個。

如采用傳代培養(yǎng)的骨髓或腹水瘤細胞，可先用0.9％的生理鹽水洗滌兩次，離心速度為800--1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗滌兩次，每次600--800r/min，離心5min，最后用甘露醇調(diào)整成每毫升含瘤細胞1×105個。

三、細胞電融合方法

1、儀2S結(jié)構(gòu)和使用方法

JCF-型細胞電融事儀的各項技術(shù)參數(shù)是通過大量的融合實驗數(shù)據(jù)，并參考島津公司(日)SSH型電融合裝置的參數(shù)值而設計的．當打開電源，指示燈亮，并撥通輸出開關(guān)和正弦輸出開關(guān)，選擇和按下正弦頻率按鍵(共分為0.6、0.8、1.3、1.5MHz五檔)，此時將輸出電纜與示波器相接，在示波器上即出現(xiàn)高頻正弦波形，當左右旋轉(zhuǎn)正弦幅度旋鈕，則正弦電壓的p-p值，也隨之降低和升高，如果將輸出電纜與電融合室相接，則細胸相互連接．此時再旋動正弦幅度(即正弦電壓)旋扭，則儀器上電壓表指針隨之升高和降低．如果正弦電壓過高，則細胞連接速度加快，并呈串珠狀，不利于兩細胞融合。

將正弦輸出開關(guān)搬至“復合輸出”檔，根據(jù)所需功率大小選拔復合輸出I或、II檔、I檔為低功率，II檔為高功率；再根據(jù)實驗要求，選擇并按下你所需要的“脈沖寬度”撥鍵(分1ms，0.2ms、0.1ms、10ms、1us五檔)和“脈沖幅度”按鍵(50V、100V、150V、200V、250V五檔)，還配有脈沖幅度旋扭(細調(diào))，調(diào)整范圍0-50V，可使每檔增值50V。

施加脈沖刺激可分為“自控”和“手控”兩檔，當使用“自控”輸出脈沖時，先將開關(guān)搬向自控檔，然后根據(jù)需要選擇并按下“脈沖頻率按健”(分為2sl次及每秒1次、2次、5次、l0次共五檔)，即可自動發(fā)送電脈沖；如果將開關(guān)搬至“手控”檔，需按動“手控”按扭，每按動一次發(fā)送一個脈沖。無論自控或手控輸出，每個脈沖輸出都伴有報鳴音響，將輸出端與脈沖示波器連接，則可觀察到由脈沖寬度、幅度及脈沖間隔所構(gòu)成的示波圖像，當改變以上有關(guān)參數(shù)值時，其圖像亦發(fā)生變化：把開關(guān)搬向反向，則產(chǎn)生負脈沖，當脈寬和幅度等值不變時，其圖像與正脈沖波形相同，但方面相反，上下對稱．將電纜輸出端與電融合室的兩電極相接，并按上述要求發(fā)送一定方波脈沖，細胞受到電刺激后，可產(chǎn)生融合。

2、電融合操作

植物原生質(zhì)體融合

開啟電源，關(guān)閉“輸出開關(guān)”，將開關(guān)搬向正弦輸出檔，此時可根據(jù)實驗需要，將正弦額度選擇在1—1.3MHz，脈沖寬度為0.1ms或)10μs，脈沖幅度為150V，脈沖頻率為1次/s，并依次按下各標定按鍵，最后調(diào)整正弦電壓(即正弦幅度)旋扭，使電壓表處于5-10V處。