相關(guān)專題 Northern Blotting技術(shù)專題

這一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛-DMSO的凝膠比含有甲醛的凝膠更難于進(jìn)行電泳， 因?yàn)榍罢哂緞?dòng)速率較慢而且需將電泳液時(shí)行循環(huán)以避免電泳過程中形成過高的H+梯度。盡管上述兩種凝膠具有近乎相等的分辨率(Miller，1987)，但用含朋乙二醛-DMSO的凝膠對(duì)RNA進(jìn)行分級(jí)離，通常Northern 雜交所顯示的RNA條帶更為銳利。

1)在滅菌的微理離心管內(nèi)，混勻下列液體：

6mol/L乙二醛 5.4μl

DMSO 16.0μl

0.1mol/L磷酸(pH7.0) 3.0μl

RNA(多達(dá)10μl) 5.4μl市售乙二醛通常為40%溶液(6mol/L)。 由于接觸空氣的后乙二醛易于氧化，所以使用前需通過混合床樹脂(Bio-Rad AG 501-X8 對(duì)乙三醛溶液進(jìn)行去離子處理，直至溶液pH值大于5.0為止，然后可分裝在小份， 用蓋緊的小管貯存于-20℃。每小份乙二醛溶液只用1次，剩余液體應(yīng)予丟棄。0.1mol/L磷酸鈉(pH7. 0)的配法如下：將3.9ml 1mol/L磷酸二氫鈉、6.1ml 1mol/L磷酸氫二鈉和90ml 水混合，用DEPC處理上述溶液后高壓滅菌。每一泳道至多可分析10μg RNA，通常用10- 20 μg 細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern 雜交，可以檢測(cè)高豐度mRNA(占mRNA總量的0.1%以上)，如等測(cè)RNA含量極微，每個(gè)泳道應(yīng)加0.5-3.0μg poly(A)+RNA。

2)將微量離心管蓋嚴(yán)，將RNA溶液置于%0℃溫育50℃溫育60分鐘后， 用冰水浴冷卻樣品，離心5秒鐘，使管內(nèi)所有液體沉降至管底。

3)于50℃溫育RNA溶液的同時(shí)，灌制瓊脂 糖水平凝膠，用1.4 %瓊脂糖分析1kb 以下的RNA樣品， 而用1%瓊脂糖分析1kb 以上的RNA樣品。 用0mmol/L 磷酸鈉(pH7. 0 )后， 降溫至70 ℃， 加入碘乙酸鈉固體至終濃度為10mmol/L(使RNA酶失活)，再降溫至50℃，制膠，加入RNA樣品前一至少放置30分鐘使其凝固。用于RNA電泳的電泳槽需用去污劑溶液洗凈，用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3%H2O2，于室溫放置10分鐘后，用經(jīng)DEPC處理的水徹底沖洗電泳槽。因乙二醛可與溴化乙錠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所以制膠和電泳過程中誚避免作用溴化乙錠。

4)將RNA樣品冷卻至0℃，加入4μl 滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的戊二醛-DMSO 凝膠中樣緩沖液，隨后立即將上述樣品加至凝膠加樣孔。用已知大小的乙醛酰RNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，如用18S和28S rRNA或或9S兔β-珠蛋白mRNA，上述RNA長度分別為6322、2366和710個(gè)堿基。也可以從BRL購置已知大小的RNA混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進(jìn)行溴化乙錠染色，可能的話應(yīng)在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留空一個(gè)泳道。

乙二醛-DMSO凝膠加樣緩沖液

50%甘油

10mmol/L磷酸鈉(pH7.0)

0.25%溴酚藍(lán)

0.25%二甲苯青FF

5)將凝膠浸入10mmol/L磷酸鈉電泳液中，以3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳，同時(shí)按圖7.1對(duì)磷酸鈉容液時(shí)行持續(xù)再循環(huán)，使溶液pH值維持在可被接受的限度 內(nèi)(pH>8.0時(shí)乙二醛將從PNA分子上解離)。另一方法為電泳時(shí)每30分鐘換一次磷酸鈉緩沖液。

6)電泳結(jié)束后(溴酚藍(lán)遷移出區(qū)8cm)，切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠條，浸入溴化憶錠溶液(0.5μg/ml，

用0.1mol/L乙酸銨配制)中染色30-45分鐘。在凝膠放置一透明遲，在紫外燈下照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離，以RPN片段大小的lg對(duì)數(shù)值對(duì)RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線計(jì)算從凝膠移到固相支持體后通過雜交檢出的RNA分子的大小。

7)RNA從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜。

將變性RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜

電泳完畢后，可立即將乙醛酰RNA自瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，有以下幾種轉(zhuǎn)移方法：毛細(xì)管洗脫法、真空轉(zhuǎn)移法和電印跡法。毛細(xì)管洗脫法如下所述， 真空轉(zhuǎn)移法和印跡法則按有關(guān)儀器生產(chǎn)廠家產(chǎn)品說明書進(jìn)行。盡管有人認(rèn)為在轉(zhuǎn)移前對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行預(yù)處理實(shí)屬不必(Thomas，1980)甚至有害(Thomas，1983)， 但我們認(rèn)為含甲醛的凝膠必須用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次，除去甲醛。 如果瓊脂糖中濃度大于1%或凝膠厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb，需用0.05mol/L氫氧化納浸泡凝膠20分鐘。 然后在凝膠上放置硝酸纖維素凝膜或尼龍膜，RNA隨向上遷移的緩沖液轉(zhuǎn)移至固相支持體(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。

1)將凝膠移至一個(gè)玻璃皿內(nèi)，用鋒利刀片修凝膠的無用部分，在凝膠左上角(加樣孔一端為上)切去一角，以作為下列操作過程中凝膠方位的標(biāo)記。

2)用長和寬均大于凝膠的一塊Plexiglas有機(jī)玻璃或一疊玻璃板作為平臺(tái)，將其放入大千烤皿內(nèi)，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20xSSC使液面略低于平臺(tái)表面，當(dāng)平上方的3MM濾紙溫透后，用玻棒趕出所有的氣泡。

3)用一把新的解剖刀或切紙刀裁一張硝酸纖維素濾膜(Schleicher &Schuell BA85或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)。濾膜的長度和寬度應(yīng)分別比凝膠大1mm， 接觸濾膜時(shí)須戴手套或用平頭鑷子(例如Millipore鑷子)，用有油膩的手接觸過的硝酸纖維素濾膜不易浸溫。

4)將硝酸纖維素濾膜浮在去離子水表面，直至濾膜從下向上濕透為止，隨后用20xSSC浸泡濾膜至少5分鐘，用干凈的解剖刀片切去濾膜一角， 使其與凝膠的切角相對(duì)應(yīng)。不同批號(hào)的硝酸纖維膜，其浸濕速率相差懸殊。如濾膜池浮在水面上幾分鐘后仍未濕透，應(yīng)另換一張新濾膜，因?yàn)槲淳鶆蚪竦臑V膜進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移是靠不住的。這種濾膜也不必丟棄，可將其夾在用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間， 高壓5分鐘。通常上述處理足以使硝酸纖維素濾膜濕透。高壓處理的濾膜應(yīng)夾在經(jīng)過高壓理理并用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間，裝入塑料袋， 密封后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>