糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定
相關(guān)專題 ? 一 、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解糖酵解過(guò)程的某一中間步驟及利用抑制劑來(lái)研究中間代謝的方法。 二 、 實(shí)驗(yàn)原理 利用碘乙酸對(duì)糖酵解過(guò)程中3-磷酸苷油醛脫氫酶的抑制作用,使3-磷酸苷油醛不再向前變化而積累。硫酸肼作為穩(wěn)定劑,用來(lái)保護(hù)3-磷酸苷油醛是不自發(fā)分解。然后用2,4-二硝基苯肼與3-磷酸苷油醛在堿性條件下形成2,4-二硝基苯肼-丙糖的棕色復(fù)合物,其棕色程度與2-磷酸苷油醛含量成正比。 三 、 儀器 原料和試劑 (1)儀器:試管(1.5×1.5cm)、吸量管(1ml、、2ml3ml)、恒溫水浴、燒杯(50ml)。 (2)原料:新鮮酵母。 (3)試劑: ①2,4-二硝基苯肼:0.1g2,4-二硝基苯肼溶于水100ml 2mol/L鹽酸溶液中,貯于棕色瓶中備用。 ②0.56mol/L硫酸肼溶液:稱取7.28g硫酸肼溶于50ml水中,這時(shí)不會(huì)全部溶解,當(dāng)加入NaOH使pH達(dá)7.4時(shí)則完全溶解。此液也可用于水合肼溶液配制,可按其分子 濃度稀釋至0.56mol/L,此時(shí)溶液呈堿性,可用濃硫酸調(diào)pH至7.4即可。 ③5%葡萄糖溶液。 ④10%三氯乙酸溶液。 ⑤0.75mol/LNaOH溶液。 ⑥0.002mol/L碘乙酸溶液。 四、操作步驟 (1)取小燒杯3只,分別加入新鮮酵母0.3g,并按下表分別加入各試劑,混勻。
杯號(hào) | 5%葡萄糖加入量/ml | 10%三氯醋酸加入量/ml | 碘乙酸加入量/ml | 硫酸肼加入量/ml | 發(fā)酵時(shí)起泡多少 |
1 | 10 | 2 | 1 | 1 | ? |
2 | 10 | -- | 1 | 1 | ? |
3 | 10 | -- | -- | -- | ? |
(2)將各杯混合物分別倒入編號(hào)相同的發(fā)酵罐 內(nèi),放入37℃保溫1.5h,觀察發(fā)酵管產(chǎn)生氣泡的量有何不同。 (3)把發(fā)酵管中發(fā)酵液傾倒入同號(hào)小燒杯中并在2號(hào)和3號(hào)杯中按下表補(bǔ)加各試劑,搖勻放10min后和第一只燒杯中內(nèi)容物一起分別過(guò)濾,取濾液進(jìn)行測(cè)定。
杯號(hào) | 10%三氯乙酸/ml | 碘乙酸/ml | 硫酸肼/ml |
2 | 2 | -- | -- |
3 | 2 | 1 | 1 |
(4)取3個(gè)試管,分別加入上述濾液0.5ml,并按下表加入試劑和處理。
管號(hào) | 濾液/ml | 0.75mol/L NaOH/ml | 室溫放置 10min | 2,4-二硝基苯肼/ml | 38℃水浴保溫19min | 0.75mol/L NaOH/ml | 觀察結(jié)果 |
1 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 3.5 | ? | ||
2 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 3.5 | |||
3 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 3.5 |
五 、 思考題 實(shí)驗(yàn)中哪一發(fā)酵管生成的氣泡最多?哪一管最后生成的顏色最深?為什么?
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